高效液相色谱法测定复方青黛片中靛蓝和靛玉红的含量

　　复方青黛片是由青黛、丹参、太子参等中药组成的复方制剂。具有清热解毒，益气生血之功效。君药青黛中的靛蓝的含量测定方法，文献报道有薄层扫描法^［1，2］、直接比色测定法^［3］和柱层层析分光光度法^［4］等，但复方制剂中靛蓝和靛玉红的含量测定，用这些方法都存在着一些缺点。本文用高效液相色谱法，同时测定复方制剂中靛蓝(Indigo)和靛玉红(Indirubin)的含量，以控制成药的质量，效果良好，定量准确、快速。

1　仪器与药品

　　高效液相色谱仪：HP 1050-DAD系统。
靛蓝供含量测定用对照品、靛玉红对照品(中国药品生物制品检定所提供)；复方青黛片样品(大连二一○医院提供)；甲醇(色谱纯)，醋酸、氯仿(分析纯)，超纯水。

2　色谱条件

　　Alltima C₁₈分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%醋酸(73∶27)；检测波长：0～11.9 min 285 nm(带宽2 nm)；12.0 min～以后，292 nm(带宽2 nm)；流速：1.0 mL^.min^-1；柱温：40 ℃。

3　实验方法

3.1　对照品溶液的制备　精密称取靛蓝、靛玉红对照品，以氯仿水浴回流溶解后，制成每1 mL含靛蓝15 μg和含靛玉红30 μg的对照品混合溶液。
3.2　供试品溶液的制备　取本品20片，除去糖衣，称定重量，研细，取细粉约0.5 g，精密称定，加氯仿100 mL水浴回流提取4 h，滤过，分取氯仿液，再用氯仿150 mL(80、70 mL)提取2次，每次1 h，合并氯仿液，蒸干，残渣加氯仿定容至25 mL量瓶中，摇匀，以0.5 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
3.3　线性关系及标准曲线　精密吸取靛蓝、靛玉红混合对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，依次进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，靛蓝、靛玉红进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程(n=5)分别为：
Y=6451.1182X　r=0.9999
Y=5619.6098X　r=0.9998
结果表明靛蓝在0.02835～0.2268 μg范围内呈线性、靛玉红在0.07175～0.574 μg范围内呈线性。
3.4　精密度试验　精密吸取对照品混合溶液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件试验，重复测定5次，靛蓝和靛玉红峰面积积分值的RSD分别为0.3%和0.5%。
3.5　稳定性试验　取样品溶液(批号960309)，在0、0.5、1、2、3、5、7 h分别进样10 μL，记录峰面积，7次测定靛蓝和靛玉红峰面积的RSD分别为0.7%和1.2%，表明供试品溶液较稳定。
3.6　重复性试验　取同一批样品(960309)5份，分别按样品测定法测定，测得5次结果：靛蓝平均含量为每片0.222 mg，RSD为0.9%；靛玉红平均含量为每片0.348 mg，RSD为1.1%。
3.7　加样回收率试验　取已知含量的样品约0.25 g，精密加入靛蓝和靛玉红的混合对照品溶液适量，挥干，按“供试品溶液的制备”项下操作，计算回收率，测得靛蓝和靛玉红的平均回收率分别为100.5%(RSD=1.7%)和98.30%(RSD=2.5%)。
3.8　空白试验　按处方比例及生产制备方法，自制不含青黛药材的阴性样品，按“供试品溶液的制备”项下制备阴性溶液，进样10 μL，记录色谱图，结果见图1-C，表明阴性样品溶液在靛蓝和靛玉红出峰处没有干扰峰。

图1　色谱图
A.混合对照品　B.样品　C.空白　1.靛蓝　2.靛玉红

4　样品的测定

　　精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1-A、B，以外标法计算样品中靛蓝和靛玉红的含量，共测定3批样品，结果见表1。

表1　样品测定结果(mg,n=3)

批号

靛蓝

靛玉红

951112

0.156

0.327

960309

0.222

0.348

960808

0.181

0.337

注：结果为每片含量

5　讨论

5.1　测定波长的选择　我们对靛蓝和靛玉红对照品溶液在190～700 nm波长范围内进行了光谱扫描，结果表明：靛蓝在239、285、605 nm处有吸收峰，以285 nm灵敏度最高；靛玉红在242、292、362、539 nm处有吸收峰，以292 nm灵敏度最高，为了满足同时分析的要求及保证分析精度，我们采用波长变换程序，分别选择靛蓝和靛玉红的最大吸收波长为测定波长进行测定，试验表明测定结果重复性好，灵敏度高。
5.2　流动相的选择　靛蓝和靛玉红为同分异构体，色谱行为极相似，我们对多种流动相进行了试验，最后选定甲醇-0.1%醋酸(73∶27)，样品中靛蓝、靛玉红及与其它组分均可达到基线分离，空白对照液亦无干扰。
5.3　供试品溶液提取方法的选择　根据青黛中靛蓝和靛玉红的特殊性质，我们曾采用了超声提取和索氏提取器回流等试验方法，结果表明：温度对靛蓝的溶解度影响很大，直接用氯仿回流提取的结果高出索氏提取器回流的2倍。故我们采用了直接回流提取的方法。
此外，光对靛蓝和靛玉红这一对同分异构体的影响也很大，样品在整个提取过程中需要避光。

作者简介　秦红霖　北京军区药品检验所
作者单位：总后卫生部药品仪器检验所　北京　100071

参考文献

1　王宝琹.中成药质量标准与标准物质研究.北京：中国医药科技出版社，1994.190
2　梁文法，闭业范，陈通等.薄层扫描法测定菘蓝根和叶中靛玉红与靛蓝的含量.中草药，1990，21(4)：11
3　邓伯林.青黛中靛蓝与靛玉红直接比色测定法.中草药，1986，17(4)：19
4　邓伯林.柱层层析分光光度法测定中药青黛中靛蓝与靛玉红的含量.中草药，1981，12(6)：11

(本文于1999年1月12日修改回)