高效液相色谱法测定洋金花药材中东莨菪碱的含量

摘要　目的：建立测定洋金花药材中东莨菪碱含量的高效液相色谱法。
方法：采用Hypersil(5 μm,4.6 mm×200 mm)色谱柱，以甲醇-水(53∶47，水中含20 mmol^.L^-1醋酸钠，0.02%三乙胺，0.3%四氢呋喃，pH为6.86)为流动相，紫外检测波长215 nm，外标法定量。
结果：东莨菪碱浓度在2～66.6 μg^.mL^-1范围内呈线性关系，方法回收率为99.09%(n=6)，RSD为0.74%。
结论：此法灵敏度高，重现性好。

Determination of Scopolamine in Flos Daturae by HPLC

He Zhijing
(State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology
of Nanjing University Nanjing，210093)

He Zhining
(Nanjing University of Science & Technology，Nanjing 210094)

Wang Jinfeng
(Nanjing First Hospital，Nanjing 210000)

Abstract　Objective：A silica gel high performance liquid chromatographic method was developed for the determination of scopolamine. Methods:Using a Hypersil column (5 μm, 4.6 mm×200 mm), the mobile phase consisted of methanol-water (53∶47, with 0.02% triethanolamine, 20 m mol^.L^-1 sodium acetate and 3% tetrahydrofuran, pH 6.86); The UV detection wavelength was 215 nm. The concentration of scopolamine was quantified by external standard method.Results: Within 2-66.6 μg^.mL^-1, scopolamine had a good linearity. The average recovery was 99.09% with RSD of 0.74%. Conclusion:The method is sensitive and reproducible.
Key words　HPLC, Flos Daturae, scopolamine

　　洋金花(Datura metel.L)为茄料白曼陀萝属药用植物，具有麻醉、解痉、镇静、镇痛、安眠等功效，其有效成分为东莨菪碱及少量的莨菪碱。到目前为止，洋金花药材中东莨菪碱含量的测定有酸碱滴定法^［1］及反相离子对色谱法^［2］。由于硅胶柱的柱效高，有利于分离一些极性和带弱正电的物质^［3，4］，因而本文采用硅胶柱色谱法(Silica gel high performance liquid chromatography)来分析洋金花药材中东莨菪碱含量，获得满意结果。此法也可用于其它生物碱的分离与测定。

1　仪器、试剂与样品材料

　　HP 1050型高效液相色谱仪，1050系列自动进样系统，四元梯度泵，DAD二极管阵列检测器及486微电脑配有HP3D化学工作站软件。
氢溴酸东莨菪碱对照品由中国药品生物制品检定所提供。经反相C₁₈柱和硅胶柱色谱法证明为色谱纯(单峰)。
甲醇为色谱纯。
洋金花由中国药科大学中药学院提供。

2　色谱条件

　　色谱柱：Hypersil 5 μm(4.6 mm×200 mm)，柱温：40℃。流动相：甲醇-水(53∶47)，其中水相中醋酸钠为20 m mol^.L^-1，三乙胺为0.02%，四氢呋喃为0.3%，用5%醋酸将pH调至6.86。流速：0.7 mL^.min^-1。紫外检测波长：215 nm。

3　线性关系的考察

　　准确称取氢溴酸东莨菪碱9.62 mg(相当于东莨菪碱6.66 mg)，甲醇溶解，定容至10 mL，摇匀，得浓度为666 μg^.mL^-1的东莨菪碱对照品贮备液。精密量取贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇分别定容至刻度，制成浓度为13.3、26.6、40.0、53.3、66.6 μg^.mL^-1的溶液。分别取各溶液10 μL，依次进样，按上述色谱条件测定。以峰面积为横坐标，以浓度为纵坐标，绘制标准曲线。对照品的色谱图见图1-A。从标准曲线可知，东莨菪碱的浓度在2～66.6 μg^.mL^-1范围内与峰面积呈线性关系。回归方程为：
Y=9.23176X-8.39935　r=0.9990

图1　东莨菪碱色谱图
A.东莨菪碱对照品　B.供试品　1.东莨菪碱

4　回收率的测定

　　准确称取已知东莨菪碱含量为0.3225%的洋金花干粉0.05 g，加入666 μg^.mL^-1的东莨菪碱对照品贮备液0.2 mL，按“洋金花药材的测定”项下的方法提取，测定，计算回收率。结果平均回收率为99.09%，RSD为0.74%，n=6。

5　精密度试验

　　取对照品溶液，重复进样5次，每次10 μL，东莨菪碱的峰面积积分值的RSD为1.40%。

6　重现性试验

　　取同一批洋金花干燥粉在不同日期，用本文方法进行提取，测定。结果RSD为0.05%(n=5)。由此表明，本法有较好的重现性。

7　提取液的稳定性试验

　　制备样品溶液后，即进行测定，东莨菪碱的含量为0.323%；将提取液于5℃的冰箱中放置48 h后，再行测定。其结果为0.320%。由此可见，在弱酸性提取液中，东莨菪碱在48 h内是稳定的。

8　洋金花药材的测定

8.1　东莨菪碱的提取　准确称取60℃干燥4 h的洋金花干粉0.05 g，置20 mL具塞试管中，加入乙醇-浓氨水-乙醚的混合液(5∶4∶10)数滴，使粉末湿润，放置过夜后，再加入乙醚10 mL，在旋涡振动器中振动，使粉末松动悬浮，置水浴中(33～34℃)微沸，提取3 h，倾出上层液，用脱脂棉过滤，滤液置小烧杯中。管中药渣再分别以10、10、5mL乙醚提取3次，每次10 min，过滤，滤液并入小烧杯中。将小烧杯置水浴上蒸干。加入0.25 mol^.L^-1硫酸1 mL，洗涤烧杯后，倒入5 mL容量瓶中，再用蒸馏水适量洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，加入0.5 mol^.L^-1氢氧化钠溶液0.9 mL，并用蒸馏水定容至刻度。高速离心(10⁴ r^.min^-1)10 min，取上清液备用。
8.2　样品测定　精密量取上清液10 μL，在确定的色谱条件下进样测定，见图1-B。根据东莨菪碱的峰面积和当天的标准曲线求出其含量(由计算机完成)。4批样品结果分别为0.320%，0.328%，0.318%，0.325%。

9　讨论

9.1　提取条件的确定　洋金花干粉用氨化的氯仿或硫酸酸化的水超声振荡提取，由于提取液中杂质太多，无法定量测定。因此参照中国药典^［1］，通过实验，确定了本文从洋金花中提取东莨菪碱的操作方法。
9.2　色谱柱的确定　用ODS柱分离洋金花提取液，东莨菪碱的峰宽，且杂质峰拖尾严重。用硅胶进行分离，东莨菪碱的峰窄，杂质峰不影响它的定量。见图1-B。
9.3　重现性的确保　硅胶柱对pH的适宜范围为2～8。在本法中作为扫尾剂使用的三乙胺^［5，6］，可使溶液呈碱性。为了避免碱性溶液对柱子的损害，而影响保留时间及峰面积的重现性，故用醋酸将溶液的pH调至6.86。另外为了防止强保留杂质滞留于柱上，每次测定后都需用乙腈洗柱3 min，接着以流动相平衡柱子4～5 min，以备后用。通过如此处理，东莨菪碱的保留时间及峰面积的重现性都很好。
9.4　检测波长的选定　东莨菪碱在260 nm和210 nm处都有吸收峰，以后者为高，但在210 nm处杂质峰的干扰又较大，故选用215 nm波长来测定，结果灵敏、准确。
9.5　东莨菪碱的定性　一是通过保留时间来确定，二是将对照品加入样品提取液，二峰完全重叠来确定。洋金花中所含的生物碱有东莨菪碱、莨菪碱^［7］，它们的碱性存在明显的差异^［8］。本文用C₁₈柱和硅胶柱反复证明文中东莨菪碱的峰为单峰。

作者单位：何执静(南京大学医药生物技术国家重点实验室　南京　210093)
何执宁(南京理工大学　南京　210094)
王金凤(南京市第一人民医院　南京　210000)

参考文献

1　中国药典.1990.一部：236
2　于霖汇，杨德柱，胡淑贤.反相高效液相色谱法测定洋金花中东莨菪碱含量.中成药，1992，14(8)：35
3　项永生，张怀玉.高效液相色谱法对中药中黄连素的快速分析.药物分析杂志，1982，2(1)：53
4　张光洲，胡学民，罗顺德等.高效液相色谱法测定莲子心中3种生物碱的含量.药物分析杂志，1997，17(2)：110
5　钱方，蒋雪涛，王安文等.反相高效液相色谱法测定血浆中氢溴酸右美沙芬浓度.药物分析杂志，1996，16(3)：147
6　李忠红，史咏梅.高效液相色谱法测定托吡卞胺滴眼液的含量.药物分析杂志，1996，16(1)：45
7　江苏新医学院编.中药大辞典.上海：人民出版社，1975.1720
8　中国医学科学院药物研究所等编.中药志.第一册.北京：人民卫生出版社,1982.227

(本文于1998年3月20日收到)