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反相高效液相色谱法测定人血浆中氨溴索浓度

来源:中国色谱网
摘要:摘要目的:建立测定血浆中氨溴索浓度的反相高效液相色谱法。方法:血浆样品用乙醚提取,醚层经0。结果:本法最低检测浓度5ng。盐酸氨溴索血药浓度测定方法有同位素标记法[3]、HPLC紫外或电化学检测法[4~6]、毛细管气相色谱法[7]等,本实验参考有关文献,建立了测定盐酸氨溴索血药浓度的高效液相......

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摘要 目的:建立测定血浆中氨溴索浓度的反相高效液相色谱法。
方法:血浆样品用乙醚提取,醚层经0.01 mol.L-1盐酸提取后进样,色谱柱为Resolve C18 4.6 mm×250 mm(5 μm),流动相为乙腈-甲醇-0.01 mol.L-1 pH 7.0磷酸盐缓冲液-四氢呋喃(350∶350∶275∶25),流速1.5 mL.min-1,检测波长242 nm,外标法峰高定量。
结果:
本法最低检测浓度5 ng.mL-1,线性范围10~320 ng.mL-1,回归方程为H=2.45+1.64 C,r=0.9995,日内RSD为2.7%~5.3%,日间RSD为3.2%~8.2%。
结论:该法适用于盐酸氨溴索片的药代动力学研究。

 

RP-HPLC Method for the Determination
of Ambroxol in Human Plasma

Li Zhen, Xu Xuejun and Hu Jinhong
(
Department of Clinical Pharmacology, Changhai Hospital,
the Second Military Medical University, Shanghai
200433)

Abstract ObjectiveA RP-HPLC method was developed for the determination of ambroxol in human plasma. Method:All samples were extracted from plasma with diethyl ether and back extraction in 0.01 mol.L-1 HCl. The analytical column was Resolve C18 (5 μm,4.6 mm×250 mm).The mobile phase consisted of acetonitrile-methanol-0.01 mol.L-1 phosphate buffer (pH 7.0)-tetrahydrofuran (35035027525). The flow rate was 1.5 mL.min-1, and the detector was set at UV 242 nm. Results: The minimal detectable plasma drug concentration was 5 ng.mL-1.The calibration curve was linear in the range of 10320 ng.mL-1(H=2.45+1.64Cr=0.9995). The RSD within day was 2.7%5.3%. TheRSD between days was 3.2%8.2%. Conclusion: This method has been applied to the pharmacokinetic study after a single oral administration of 90 mg ambroxol hydrochloride tablets in 8 healthy volunteers.
Key words ambroxol hydrochloride,HPLC,plasma drug concentration,pharmacokinetics

  盐酸氨溴索(Ambroxol hydrochloride),化学名为反-4-[(2-氨基-3,5-二溴苯甲基)氨基]环己醇盐酸盐,是溴己新的活性代谢产物[1],可明显减少咳痰和呼吸困难,并具有促进肺表面活性物质和气道液分泌及纤毛运动的多重作用,它毒性低,祛痰和改善肺功能作用较强,临床上主要用于急慢性呼吸道疾患,特别是慢性支气管炎的祛痰治疗[2]
盐酸氨溴索血药浓度测定方法有同位素标记法
[3]、HPLC紫外或电化学检测法[4~6]、毛细管气相色谱法[7]等,本实验参考有关文献,建立了测定盐酸氨溴索血药浓度的高效液相色谱方法,并用该法对德国Boehringer Ingelheim提供的盐酸氨溴索片(Mucosolvan,沐舒痰)在健康人体内的药物动力学进行了研究,为临床合理使用提供依据。

1 仪器与试药

  日立655系列HPLC仪,包括655A-12型恒流泵,655A-22型可变波长紫外检测器和655B-71型微处理机;Rheodyne 7125进样阀,配以50 μL定量管。
盐酸氨溴索对照品由江苏连云港制药厂提供,含量99.70%;Mucosolvan由德国Boehringer Ingelheim药厂提供,每片30 mg,Batch No.40027。甲醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯;乙醚、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠、氯化钾、磷酸均为分析纯;水为重蒸馏水。缓冲液配制好后均经0.45 μm的滤膜过滤。
0.01 mol
.L-1 pH 10.0磷酸盐缓冲液配制:取磷酸6.183 g,加入氯化钾7.456 g,加水至1 000 mL,溶解混合均匀后,取出500 mL,加入0.1 mol.L-1氢氧化钠溶液439 mL,加水至1 000 mL。
0.01 mol
.L-1 pH 7.0磷酸盐缓冲液配制:取磷酸二氢钾0.54 g和二水合磷酸氢二钠1.07 g,加水至1 000 mL。

2 色谱条件

  分析柱为Resolve C18(中科院大连化物所,4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相采用乙腈-甲醇-0.01 mol.L-1 pH 7.0磷酸盐缓冲液-四氢呋喃(350∶350∶275∶25),流速1.5 mL.min-1,检测波长242 nm,室温25℃下操作。盐酸氨溴索的保留时间为3.96 min,空白血浆、对照品血浆及受试者血样的HPLC图谱见图1所示。

图1 盐酸氨溴索的HPLC色谱图
a.空白血浆 b.血浆对照品(40 ng
.mL-1) c.血样(服药后1.5 h)

3 样品处理

  取血浆0.5 mL,置10 mL具塞玻璃离心管中,加入0.01 mol.L-1 pH 10.0磷酸盐缓冲液0.5 mL和乙醚 4.0 mL,封口后涡旋混匀60 s,3500 r.min-1离心6 min,醚层转至另一10 mL具塞玻璃离心管中,加入0.01 mol.L-1盐酸200 μL,涡旋混匀60 s,3500 r.min-1离心6 min,弃去醚层,酸层进样50 μL。

4 标准曲线制备

  精密称取盐酸氨溴索对照品25 mg,用蒸馏水定容于25 mL的容量瓶中,使成1 mg.mL-1的对照液。
取健康人空白血浆共6份,依次加入盐酸氨溴索对照液使成10、20、40、80、160和320 ng
.mL-1的不同浓度,按前述方法处理后进样,以所测峰高对浓度进行线性回归。结果表明氨溴索血浆浓度在10~320 ng.mL-1范围内线性良好,回归方程为:
H=2.45+1.64C r=0.9995
检测限为0.25 ng(
S/N=3),血浆中最低检测浓度为5 ng.mL-1

5 回收率试验

  空白血浆加入盐酸氨溴索对照溶液,使成20、80和320 ng.mL-1不同浓度,按血浆样品处理后进样,与相应的对照液峰高相比得到绝对回收率;血浆标准曲线上求得浓度与实际浓度相比得到相对回收率。结果见表1。

表1 回收率测定结果(n=5)

浓度
/ng
.mL-1

绝对回收率
±
RSD/%

相对回收率
±
RSD/%

20

81.42±4.0

102.4±5.3

80

81.65±1.9

101.3±2.1

320

83.45±2.7

96.44±2.7

x

82.17±3.0

100.0±4.3


6 精密度试验

  配制高、中、低3种浓度的对照品血浆各5份,同法测定,计算方法的日内及日间精密度,结果见表2。

表2 精密度测定结果(n=5)

加入量
/ng
.mL-1

日内

日间

测得量
/ng
.mL-1

RSD
/%

测得量
/ng
.mL-1

RSD
/%

20

21.87

5.3

22.00

8.2

80

86.44

2.1

85.17

3.0

320

329.60

2.7

324.00

3.2


7 药物动力学研究

  男性健康志愿者8名,年龄22~24岁,平均(22.75±1.04)岁,体重57~70 kg,平均(64.25±6.58)kg,身高164~180 cm,平均(171.63±4.60)cm,所有志愿者受试前经体检心、肝、肾功能均正常,试验前一月内未服任何药品,均签署知情同意书并上报上海长海医院医学伦理委员会批准备案。
8名健康志愿者空腹单剂量口服盐酸氨溴索片3片(90 mg),200 mL温开水送服,用药后3 h进食统一早餐,并于给药前及给药后的0.5、1.0、1.5、2、3、4、6、9、12、15、24 h分别取静脉血2.0 mL,肝素抗凝,3500 r
.min-1离心后分离血浆,置-20 ℃保存,按上述方法提取测定血药浓度。8名受试者单剂量口服90 mg盐酸氨溴索片后,平均血药浓度-时间曲线见图2所示。

图2 8名受试者口服90 mg Mocosolvan的平均血药浓度-时间曲线

  将8名健康志愿者不同时间测得的血药浓度用3P87程序经计算机自动迭代拟合,结果显示盐酸氨溴索在健康人体内的药物动力学过程呈二室开放模型,得出的有关药动学参数Ka,Cmax,tmax,t1/2β和AUC分别为(0.69±0.18)h-1,(163.17±32.41)ng.mL-1,(1.44±0.23)h,(7.97±1.17)h和(1307.28±142.69)h.ng.mL-1,主要药动学参数与国外文献报道一致[8]

8 讨论

  血浆中盐酸氨溴索采用乙醚提取,平均回收率大于80%,乙醚层再经0.01 mol.L-1盐酸提取后直接进样,无内源性杂质干扰测定。由于不需吹干,测定快速简便,适用于大批量生物样品的测定。
氨溴索血药浓度HPLC测定方法国内未见报道,国外文献较多。采用电化学检测器,样品需要衍生化,可显著提高检测灵敏度,但对溶剂的要求高,费时费力,我们采用HPLC-紫外色谱系统测定其浓度,确定检测波长为242 nm,本法测定血浆中氨溴索浓度线性范围为10~320 ng
.mL-1,最低检测浓度为5 ng.mL-1,能够满足盐酸氨溴索片的药物动力学研究的需要。

作者单位:第二军医大学长海医院临床药理室 上海 200433

参考文献

1 于书海,田世雄,何文等.盐酸氨溴索的合成.中国医药工业杂志,199627(10)435
2
 罗慰慈,甘春兰,朱文钰等.沐舒痰临床疗效验证63例总结.中国新药杂志,19921(5)23
3
 Hammer R, Bozler G, Jauch R,et al. Speziesvergleich in pharmakokinetik und metabolismus von NA 873 Cl ambroxol bei ratte, kaninchen, hund und mensch. Arznei Forsch, 1978, 28 (I): 899
4
 Botterblom MHA, Janssen TJ, Guelen PJ, et al. Rapid and sensitive determination of ambroxol in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr, 1987421(1)211
5
 Nobilis M, Pastera J, Svoboda D, et al. High-performance liquid chromatographic determination of ambroxol in human plasma.J Chromatogr, 1992, 581(2):251
6
 Flores MFJ, Hoyo VC, Hong E, et al. Assay of ambroxol in human plasma by high-performance liquid chromatograph with ampermetric detection. J Chromatogr, 1989, 490 (2): 464
7
 Schmid J. Assay of ambroxol in biological fluids by capillary gas-liquid chromatography. J Chromatogr, 1987, 414 (1): 65
8
 Vergin H, Bishop-Freudling GB, Miczka Met al. Untersuchungen zur pharmakokinetik und bioaquivalenz unterschiedlicher darreichungsformen von ambroxol. Arzneim Forsch, 1985, 35()1591

(本文于1998320日收到)

 

作者: 李珍徐学君胡晋红 2007-5-18
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