高效液相色谱法测定2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷和2-氯-4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷含量及其稳定性的研究

摘要　
目的：用HPLC法建立了测定CNP-Gal和CNP-NAG含量的方法，并对上述2种物质的稳定性进行了研究。
方法：采用CLC-CN柱(6.0 mm×150 mm)，以二氯甲烷-甲醇-正己烷-二氧六环(4∶1∶6∶1)为流动相，流速为1 mL^.min^-1；用紫外检测器于290 nm波长处测定。测定CNP-Gal含量时，以2，4-二硝基苯肼为内标物；测定CNP-NAG含量时，以CNP-Gal为内标物。
结果：CNP-Gal与CNP-NAG的平均回收率分别为99.98%、99.97%。回收实验的相对标准偏差均小于1。
结论：上述2种物质对光和热均较稳定，但在极性强的溶媒(如水、醇等)中会迅速分解。

Study on the Determination and Stability of 2-Chlor-4-Nitrophenylene-β-D-Galactose Glycoside(CNP-Gal)and 2-Chlor-4-Nitrophenylene-N-Acetoacetic-β-D-Glucosaminide(CNP-NAG)by HPLC

Wang Yujie and Zhang Li
(Tianjin Municipal Institute for Drug Control,Tianjin 300070)

Abstract　Objective：This paper reported the determination of CNP-Gal、CNP-NAG and study on their stability by HPLC.Methods:The chromatographic conditions were column,Shim-Pack CLC-CN(6.0 mm×150 mm);mobile phase,dichloromethane-methanol-hexane-dioxane(4∶1∶6∶1);flow rate,1 mL^.min^-1;multiwavelength detector at 290 nm;internal standard,2,4-dinitrophenylhydraxine(It was a internal standard,when CNP-Gal was determined) and CNP-Gal(It was a internal standard,when CNP-NAG was determined).Results:The average recovery of CNP-Gal and CNP-NAG were 99.98%、99.97% separately.The RSD of the recovery is ＜1.0%.Conclusion:CNP-Gal and CNP-NAG were found that they were stable under 4000lx(42 hours) and 60 ℃(504 hours),but they willdecompose quickly in the polar solvents.
Key words　HPLC，CNP-Gal，CNP-NAG，determination，stability

　　2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(CNP-Gal)和2-氯-4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(CNP-NAG)为肾脏疾病的早期诊断药品。CNP-Gal和CNP-NAG于1988年及1984年分别由美国、日本等国研制成功。我国于1990年研制成功。经查阅近8年的美国《化学文摘》及国内有关刊物，其测定方法均未见报道。为此，我们建立了上述2种诊断药品的测定方法。现报道如下：

1　仪器与试剂

　　日立L-6200型高效液相色谱仪，检测器为日立2000-10型紫外/可见光检测器，岛津C-R1A数据处理机，色谱柱为岛津Shim-Pack CLC-CN柱(10 μm，6 mm×150 mm)。
对照品为天津市医药科学研究所合成室提供的精制品，经HPLC测得CNP-Gal和CNP-NAG的含量分别为99.9%、99.7%。供试品亦由上述单位提供。
内标物：2，4-二硝基苯肼(分析纯)，用《中华人民共和国石油化学工业部部标准》(HG 3-965-76)规定的方法测得含量为99.3%。
以上各试样在使用前均于常温下真空干燥8 h。
二氯甲烷、甲醇、正己烷、二氧六环及乙酸乙酯均为分析纯。

2　色谱条件

　　岛津Shim-Pack CLC-CN柱，二氯甲烷-甲醇-正己烷-二氧六环(4∶1∶6∶1)为流动相，测定CNP-Gal含量时，以2，4-二硝基苯肼为内标物；测定CNP-NAG含量时，以CNP-Gal为内标物，检测波长为290 nm，流速为1 mL^.min^-1，进样20 μL，室温。在上述条件下，样品的典型分离情况见图1、2，有关色谱参数见表1。

图1　CNP-Gal与2，4-二硝基苯肼的分离图
1.2，4-二硝基苯肼(内标物)　2.CNP-Gal

图2　CNP-NAG与CNP-Gal的分离图
1.CNP-Gal(内标物)　2.CNP-NAG

表1　有关色谱参数

2，4-二硝基苯肼

CNP-Gal

CNP-NAG

保留时间/min

4.37

7.72

10.29

理论板数

2740

1800

3020

分辨率

6.7

2.2

3　线性范围

3.1　CNP-Gal的线性范围　精密称取CNP-Gal对照品50、40、30、20、10 mg，各加二氯甲烷-甲醇(2∶1)混合液80 mL，超声振荡使溶解后，再各加正己烷-二氧六环(6∶1)混合液使成100 mL，作为对照品溶液。另精密称取内标物2，4-二硝基苯肼为50 mg，用乙酸乙酯溶解并稀释至50 mL，作为内标溶液。精密量取上述各对照品溶液5 mL，分别置10 mL量瓶中，各精密加入内标溶液2 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μL。以3次测定的峰面积平均值的数据作回归方程。结果为：
Y=-0.006503+1.0968C　r=0.9998
CNP-Gal进样量在1～5 μg范围内与内标2，4-二硝基苯肼4 μg的峰面积比呈线性关系。
3.2　CNP-NAG的线性范围　精密称取CNP-NAG对照品40、32、24、16、8 mg，各加二氯甲烷-甲醇(2∶1)混合液80 mL，超声振荡使溶解后，再各加正己烷-二氧六环(6∶1)混合液使成100 mL，作为对照品溶液。另精密称取内标物CNP-Gal 60 mg，同上法处理制成0.6 mg^.mL^-1的溶液，作为内标溶液。精密量取上述各对照品溶液5 mL，分别置10 mL量瓶中，各精密加入内标溶液2 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μL。以3次测定的峰面积平均值的数据作回归方程。结果为：
Y=-0.004490+0.7814C　r=0.9999
CNP-NAG进样量在0.8～4 μg范围内与内标CNP-Gal 12.4 μg的峰面积比呈线性关系。

4　校正因子的测定

　　取CNP-Gal与2，4-二硝基苯肼的混合标准液(CNP-Gal 0.15 mg，2，4-二硝基苯肼0.2 mg^.mL^-1)，进样20 μL，5次测得的校正因子平均值为0.460，RSD为0.73%。
另取CNP-NAG与CNP-Gal的混合标准液(CNP-NAG 0.12 mg，CNP-Gal 0.12 mg^.mL^-1)，进样20 μL，5次测得的校正因子平均值为1.077，RSD为0.46%。

5　回收实验

　　精密称取各对照品及内标物适量，配制成5种不同浓度的对照品及内标物的混合溶液，摇匀，进样20 μL，计算回收率。结果CNP-Gal与CNP-NAG的平均回收率分别为99.98%、99.97%，RSD分别为0.72%和0.46%。

6　溶液的稳定性试验

　　将样品置于无色透明的量瓶中，每隔1 h测定1次，共考察了4 h，结果表明，溶液在4 h之内，其峰面积基本不变。

7　样品的测定

　　以建立的上述方法测定多批样品，并与外标法做比较，实验表明，内标法和外标法测得的结果基本一致。结果见表2。

表2　样品测定结果(%，n=3)

名　称

批　号

内标法

外标法

CNP-Gal

920320

100.2(0.72)

99.3

920410

99.8(0.34)

99.5

920417

99.6(0.19)

99.1

CNP-NAG

920603

99.5(0.65)

99.4

920807

99.4(0.38)

99.3

920924

99.4(0.58)

99.7

注：括号内为RSD(%)

8　样品稳定性的加速试验

8.1　光照对样品稳定性的影响　分取CNP-Gal(批号为920417)和CNP-NAG(批号为920807)样品，置光照度为4000lx下直接照射42 h，每隔数小时测定1次。实验表明，上述2种诊断药品对光较稳定。
8.2　加热对样品稳定性的影响　分取CNP-Gal(批号为920320)和CNP-NAG(批号为920603)样品，在60 ℃下加热不同时间，每隔3 d测定1次，共考察了21 d。实验表明，上述2种诊断药品对热较稳定。

9　讨论

9.1　色谱系统的选择　CNP-Gal和CNP-NAG 2种诊断药品在如水、甲醇等的强极性溶液中易分解成糖苷和2-氯-4-硝基酚(CNP)，致使溶液变黄。故此，将分析方法选择为氰基柱的正相高效液相色谱法。在建立分析条件时，曾比较了多种不同比例的氯仿-甲醇-正己烷系统，均未得到良好的分辨率。同时，还选择了数种其他流动相系统(如氯仿-乙腈-正己烷系统、二氯甲烷-甲醇-正己烷系统等)，仍不理想，最后，将流动相系统选定为：二氯甲烷-甲醇-正己烷-二氧六环(4∶1∶6∶1)，可得到良好的分辨率。
经对数批样品试验，证明：2种药品互不相含，可采用互为内标的方法定量，亦可采用外标法定量。
9.2　溶媒及溶解方式的选择　实验证明，上述2种药品难溶于氯仿及二氯甲烷，加入适量的甲醇可使样品溶解，但只加甲醇时，则使样品分解。经实验，以适量二氯甲烷-甲醇(2∶1)混合液溶解样品，为使溶媒系统尽可能地与流动相相似，在溶解完样品后，加入正己烷-二氧六环(6∶1)混合液适量配制成适当浓度的样品溶液。
溶解样品时采用超声振荡。实验表明，样品在超声前后的红外图谱及高效液相色谱图均未发生变化，超声振荡不影响样品的结构。
9.3　小结　上述2种药品在光照及加热下含量稍有下降，实验证明，系分解为CNP和糖苷所致。

作者单位：天津市药品检验所　300070

(本文于1998年5月5日收到)