高效液相色谱法检测血清中的高三尖杉酯碱

摘要　目的：利用高效液相色谱法测定血清中的高三尖杉酯碱的含量。
方法：以内标法为基础，取1 mL血清标本加入内标三尖杉酯碱，经二氯甲烷2次重复提取，减压蒸干，残渣用流动相溶解，进样。色谱条件：以C₁₈反相柱为分析柱，流动相组成为0.1 mol^.L^-1甲酸铵－甲醇(2∶1)，流速为1.0 mL^.min^-1，在紫外检测器波长290 nm处进行检测。
结果：方法学检查：最低检测限2 ng^.mL^-1，在4～1 500 ng^.mL^-1范围内呈线性，回收率91.3％(n=8)，批内和批间的相对标准偏差分别为1.2%(n=8)和3.6%(n=4)。
结论：对临床化疗常与之配伍使用的3种药物，进行干扰实验，未发现干扰峰。

Determination of the Content of Homoharringtonine
in Serum by HPLC

Yang Ming，Yang Chunzheng，Ma Jianguo，Bian Shougeng and Xue Yanping
(Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital,CAMS and PUMC,Tianjin　300020)

Abstract　Objective：Determination of the content of homoharringtonine(HHT)in Serum by HPLC is reported.Method:On the basis of internal standard method,1.0 mL serum sample was extracted by CH₂Cl₂ two times. The organic phase was evaporated by HBI vortex evaporator.The residue was dissolved in mobile phase and injected to HPLC. The C₁₈ reversed-phase column was used, mobile phase:methanol-0.1 mol^.L^-1 ammonium formate (1∶2),flow rate 1.0 mL^.min^-1 and harringtonine(HT) as internal standard.The detection was carried out with an ultraviolet detector (λ=290 nm ).Results:The detection limit of HHT was 4 ng^.mL^-1. The linearity was in the range of 4～1 500 ng^.mL^-1.The absolute recovery of HHT and HT was respectively 91.25%(n=8) and 92.75%(n=4).The between-day RSD HHT was 1.23%(n=8), and intra-day RSD was 3.55%(n=4)respectively.Conclusion：We did not find any interference peak from three commonly drugs(ADR,DNR and Ara-C) used in combination therapy.
Key words　homoharringtonine,harringtonine,HPLC

　　高三尖杉酯碱(Homoharringtonine，HHT) 系从三尖杉属植物的总生物碱中分离出的一种生物碱，是我国自行研制成功的高效抗肿瘤药，临床证明对急性粒细胞白血病，急性单核细胞白血病，红系白血病等，各种急性非淋巴性白血病及慢性粒细胞白血病均有较好疗效^［1，2］。但其具有极强的细胞毒性，亦可导致心脏毒性及骨髓抑制，限制了化疗剂量的增加。对其进行血药浓度监测非常必要。
目前国外有关高三尖杉酯碱测定的报道很多^［3～6］，但应用高效液相色谱法检测的却很少^［6］，国内曾建立了小鼠生物样本的荧光检测方法^［5，6］。我们采用高效液相色谱仪的紫外检测方法。该方法稳定、专一、灵敏，可用于临床高三尖杉酯碱的血药浓度监测。

1　测定原理

　　以内标法为基础，血清标本中加入内标三尖杉酯碱(Harringtonine,HT)， 经二氯甲烷2次重复提取，减压蒸干，残渣用流动相溶解，进样。用C₁₈反相柱进行色谱分析，在波长290 nm进行检测，以峰高的比值进行定量。

2　材料和方法

2.1　标本的收集与保存　取全血离心后，取上层血清，置于玻璃试管中，立即测定，如不能立即检测应放入-20 ℃下保存，1周内测定。
2.2　仪器　高效液相色谱仪：Waters510泵、486紫外可见光检测器、U6K进样阀。色谱柱:Nova-Pak C₁₈，3.9 mm×150 mm，填料为4 μm球形。PC800色谱工作站。
2.3　试剂　对照品：HHT、HT均由中国医学科学院药物研究所实验药厂购得，含量均为99.98%。溶剂：甲醇为色谱纯；二氯甲烷、甲酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠为国产分析纯；水用Millipore超纯水器生产。
2.4　溶液配制
对照溶液：室温下分别配制HHT、HT的对照溶液，浓度为0.2 mg^.mL^-1,密封。置于4℃冰箱保存， 用前取出至室温后使用。
流动相:甲酸铵(0.1 mol^.L^-1)和甲醇2∶1混合，混匀后用过滤膜滤过脱气。
2.5　样品预处理　取10 mL圆底具塞试管，于试管中加入血清1 mL，加入内标物(HT)200 ng及生理盐水(NS)0.5 mL混匀，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH=9.4) 0.5 mL调pH，用二氯甲烷3 mL重复提取2次，合并2次的下层有机相，减压涡漩振荡蒸干，取流动相100 μL溶解进样。
2.6　色谱分析条件　分析柱：Nova-Pak C₁₈，3.9 mm×150 mm，4 μm 。 检测波长：230 nm，流速：1.0 mL^.min^-1。室温下检测。
2.7　计算　在PC800色谱工作站中设置好参数（采样时间：10 min，采样速率：2 pt^.s^-1，噪音阈：100.00 μV，切割比例：5000.00，最小面积：20.00 μV.s，最小峰高：100.00 μV，最小峰宽：0.00 s），得出HHT及HT的血清对照品的峰高。以HHT和HT 峰高的比值作纵坐标，以浓度为横坐标，计算标本的血药浓度。

3　结果

3.1　色谱图　空白无内源干扰物的血清1 mL，加入HT 200 ng及HHT 400 ng对照品，经二氯甲烷2次重复提取，减压蒸干，残渣用流动相溶解，进样。用C₁₈反相柱进行色谱分析，在波长290 nm进行检测，以峰高的比值进行定量。HT及HHT均达基线分离，两药出峰时间分别为5.48 min和8.01 min，色谱分析在10 min内完成(图1)。

图1　高三尖杉酯碱的色谱图
A.HHT及HT的对照品　B.空白血清　C.含HHT及HT的血清
1.三尖杉酯碱　2.高三尖杉酯碱

3.2　线性关系及线性范围　在上述实验条件下的血药浓度(X)与峰高比(Y)的线性关系良好，回归方程(n=8)为：
Y=-0.0036+0.00391X　r=0.9996
3.3　检出限　以引起2倍噪音的药量为最低检测量，以经过预处理后的药量等于最低检出浓度。高三尖杉酯碱的最低检出浓度为：4 ng^.mL^-1。
3.4　回收率　分别制备40、200 ng^.mL^-1的HHT及200 ng^.mL^-1的HT血清对照溶液，一式4份。HHT的回收率：40 ng^.mL^-1组为89.78%±3.08%(n=4),200 ng^.mL^-1组为92.78%±1.53%(n=4),平均回收率91.25%±2.7%(n=8)。HT组为92.75%±1.08%(n=4)，与HHT基本相同。
3.5　精密度　选2个浓度40 ng^.mL^-1及200ng^.mL^-1，各4份样品，提取及检测方法如前所述作批内标准偏差，并选取一个浓度作批间的变异。 批内与批间标准偏差分别为1.23%(n=8)和3.55%(n=4)。
3.6　干扰实验　在上述色谱条件下，针对临床化疗常与之联合使用的3种药物(阿霉素、柔红霉素、阿糖胞苷等)进行干扰实验，均未发现干扰峰。

4　讨论

4.1　色谱体系的选择　因HHT为碱性药物，所以采用C₁₈反相色谱柱，它还可以使选取中的内源性极强的成分很快地被洗脱下来（在3 min之前)，避免了对测定药物的干扰。至于流动相中的甲醇含量，我们以甲醇和甲酸铵的浓度比值作线性梯度(0～100%)，将其容量因子比较,甲醇含量在50%以上时HT与HHT很难分开，而在70%时容量因子分别为1.97和4，分离效果最佳， 所以在0.1 mol^.L^-1甲酸铵－甲醇(2∶1)时，可得到满意的分离度。
4.2　样品的预处理　因HHT具有较强的细胞毒性，亦可导致心脏毒性及骨髓抑制， 限制了化疗剂量的增加，临床应用时病人的给药量为4 mg。为了避免提取过程中的丢失，减轻提取过程中的乳化是很必要的，经过多次实验，确定了此方法。本方法简便、快速、试剂易得，现已应用于临床，对白血病患者化疗时进行血药浓度监测并发现给药后12 h与6 h的血药浓度比与疗效有关(将另文发表)。

作者单位：中国医学科学院协和医科大学血液学研究所　天津　300020

参考文献

1　徐承雄,韩　锐.高三尖杉酯碱对体外培养L1210细胞的杀伤作用.中国药理学报,1989,10(6)：546
2　徐承雄,韩　锐，郭哲人等.三尖杉酯碱及高三尖杉酯碱对体外培育肿瘤细胞集落形成率的影响.中国医学科学院学报，1987,9(1):18
3　Legha SS,Keating I,Picket S,et al.Phase 1 Clinical investigation of Homoharringtonine.Cancer Treat Re, 1984,68(9):105
4　Ajani JA,Dimery I,Chawla SP, et al.Phase Ⅱ Studies of Homoharringtonine in patients with advanced malignant melanoma: sarcoma and head and neck, breast and colorectal carcinomas.Cancer Treat Re ,1986,70(3):375
5　NiramoL S,Kaeterine Lu,Dimery I,et al.Clinical pharmacology of Homoharringtonine.Cancer Treat Re,1986,70(20):1430
6　Han Jui,John Roboz.Quantitation of harringtonine and homoharringtonine in serum by high-performance liquid chromatography.J Chromatogr,1982,233(10):203

(本文于1998年2月12日收到)