反相离子对色谱法测定维乐生片中维生素B1和B6的含量

　　维乐生片是3种维生素B的复合制剂，有糖衣片和薄膜衣片2种剂型，每片含维生素B₁ 100 mg，维生素B₆ 100 mg、维生素B₁₂ 200 μg，主要用于治疗三叉神经痛，脊骨痛，坐骨神经痛，周期性偏头痛及周围性面神经麻痹，肢体麻木等症。该品种在广东省药品标准1987年版上有收载，其维生素B₁的含量测定方法是采用沉淀重量法，操作较繁琐费时；维生素B₆的含量测定方法是采用紫外分光光度法。本文用反相离子对色谱法^［1］同时测定维生素B₁与B₆的含量，方法简便，结果满意，与广东省药品标准方法对比，结果一致。
1　仪器与试药
日本岛津LC－10A高效液相色谱仪；SPD－10A紫外检测器；C－R6A数据处理机。色谱柱：Lichrospher 100 R P－18(5 μm)，4 mm×125 mm(德国默克公司制造)。维乐生薄膜衣片由广州光华药业股份有限公司生产；对照品维生素B₁(含量99.0%)由上海新亚制药厂提供；对照品维生素B₆(含量99.8%)由南京制药厂提供；其它试剂均为分析纯。
2　线性方程与回收试验
2.1　对照品贮备液的制备　精密称取维生素B₆与B₁对照品各62.5 mg，置同一100 mL量瓶中，加流动相适量振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。此溶液为含对照品维生素B₁与B₆各625 μg^.mL^-1的混合溶液。
2.2　线性试验　分别取对照品贮备液0.5、1、2、4、8、16 mL置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，维生素B₆与B₁的浓度均为12.5、25、50、100、200、400 μg^.mL^-1。以C₁₈为固定相，甲醇-0.06 %庚烷磺酸钠溶液(含1.2%冰醋酸与0.12%三乙胺)(25∶75)为流动相，检测波长为275 nm,进样20 μL，记录各浓度的色谱峰面积，以浓度为X，峰面积为Y，求得维生素B₆、B₁的回归方程分别为：
Y=30693.45+20038.67X　r=0.99998
Y=13537.88+24738.08X　r=0.99998
2.3　回收试验　取已准确测定含量的样品片粉适量(约相当于维生素B₁与B₆各50 mg)置50 mL量瓶中，加流动相适量，超声10 min，并稀释至刻度，摇匀，滤过，精取续滤液5.0 mL置另一50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取此液1、2、3、4、5、6 mL分别置10 mL量瓶中，各加对照品贮备液1.0mL，用流动相稀释至刻度，按样品测定项下方法进行加样回收试验，测得维生素B₆、B₁平均回收率分别为99.6 %、99.2 %，RSD分别为0.8 %、0.9%，n=6。
3　样品测定
取样品10片，精密称定，研细，精取片粉适量(约相当于维生素B₁与B₆各50 mg)置50 mL量瓶中，加流动相适量，超声10 min使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5.0 mL于另一50 mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀。另取维生素B₁与B₆对照品用流动相制成浓度均为100 μg^.mL^-1的混合溶液，在选定的色谱条件下对照品溶液与样品溶液分别进样20 μL,记录各自的色谱峰面积，用外标法计算样品中维生素B₁与B₆含量，测定样品3批并与广东省药品标准法对比，结果见表1。

表1　样品测定结果 (%)

批　号

维生素 B₆

维生素 B₁

标准法

HPLC法

标准法

HPLC法

9710008

99.9

100.2

94.6

95.3

9710009

96.0

97.9

95.7

95.2

9710010

94.3

97.9

94.2

98.1

　　将用2种分析方法分别测得的结果进行t检验，求得维生素B₆含量的t=1.057＜t_0.025，4=2.776；维生素B₁含量的t=1.332＜t_0.025,4=2.776，说明这2种分析方法没有显著差别。

4　精密度和稳定性试验
取制备好的样品溶液重复进样5次，峰面积不变，维生素B₆及B₁的RSD分别为0.7 %、0.8 %，n=5。取同一份样品溶液分别在0、4、8、24 h进样测定，峰面积基本不变，维生素B₆、B₁的RSD分别为0.9 %、0.7 %。
5　讨论
5.1　维乐生片含维生素B₁、B₆和B₁₂ 3种成分，其中B₁₂浓度很低(200 μg^.片^-1)，通过绘制3种成分的紫外吸收光谱，选定275 nm为检测波长，在此波长维生素B₁与B₆吸收度适宜，能满足测定的需要。在此色谱条件下，用维生素B₁₂对照品配制与样品溶液中维生素B₁₂同浓度的溶液，并加入空白辅料，使溶解后滤过，取续滤液注入色谱仪，无色谱峰出现(图1－A)，将其中维生素B₁₂浓度提高至样品溶液中维生素B₁₂浓度的100倍，在2.4 min左右出现一尖锐小峰，这是B₁₂的色谱峰，故由于B₁₂浓度极低，在此色谱条件下对B₁与B₆的含量测定无影响。
5.2　维生素B₁与B₆均为水溶性维生素，在水中均易溶，故能很好地溶于本方法所选择的流动相中，且由于两者极性均较大，在C₁₈柱上保留较弱，通过加入离子对试剂庚烷磺酸钠以延长其保留时间，加入扫尾剂三乙胺以改善峰形，使整个色谱过程在10 min内完成，维生素B₆保留时间为3.7 min，B₁为7.5 min，B₁与B₆的分离度可达4.1(图1－B).

5.3　由于本品为薄膜衣片，用广东省药品标准1987年版方法检验时要求取20片除去薄膜衣再进行含量测定，本法可不去薄膜衣直接研细取样，简化了操作。

*　广东医药学院98届毕业生
作者单位：杨　颖　黄　俊^*广州市药品检验所　510160
本文于1998年2月25日收到

参考文献
1　韩　俊，方镇文.反相离子对液相色谱法同时测定肝得健胶囊中维生素B₁，B₂，B₆和烟酰胺的含量.药物分析杂志，1995，15(增刊)：182