高效液相色谱法测定仙茅中仙茅苷的含量

　　摘要　目的：建立反相高效液相色谱法测定仙茅中仙茅苷的含量。
方法：样品经甲醇提取，色谱柱为Alltima C₁₈(5 μm ,4.6mm×250mm)，柱温40 ℃，甲醇－异丙醇－水（20∶5∶75）为流动相，流速1.0 mL^.min^-1，检测波长283 nm。
结果：仙茅苷在0.25～2.59 μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率为99.67%，RSD为2.6%(n=4)。
结论：本方法简便、可靠，重现性好。

Determination of Curculigoside in Rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn.by HPLC

Wu He ,Liu Yun and Chen Yumin
(Institute for Drug & Instrument Control of PLA,Beijing　100071)

　　Abstract　Objective：An assay method was set up for the determination of curculigoside in rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn.by HPLC .Methods:The chromatographic conditions were as follows:Alltima C₁₈ column(5 μm,4.6 mm×250 mm ),the mobile phase methanol－isopropylalcohol-water (20∶5∶75) and detection at 283 nm.Results:The calibration curve was in good linearity over the concentration range of 0.25～2.59 μg (r=1.0000). The average recovery was 99.67%,RSD was 2.6%(n=4).Conclusion:The method is simple,reliable and reproducible.
　　Key words　HPLC, Curculigo orchioides Gaertn., curculigoside

　　仙茅为石蒜科植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根茎。具有补肾阳，强筋骨，祛寒湿的功效，用于阳痿精冷、筋骨痿软、腰膝冷痹、阳虚冷泻等症。仙茅中含有仙茅苷(Curculigoside)、苔黑酚葡萄糖苷(Orcinol glucoside)^［1］、仙茅素A(Curculigine A)^［2］、仙茅苷乙(Curculigoside B)、仙茅素B和C(Curculigine B,C)^［3］等。其中仙茅苷经药理试验证明能大幅度促进巨噬细胞的增生能力和吞噬作用，提高机体免疫力^［1］。仙茅中仙茅苷的含量测定方法文献报道仅见有薄层扫描法^［4］。本文通过反复试验，建立了一种操作简便、重现性好的高效液相色谱方法，为进一步评价仙茅药材的品质提供了可靠的方法。
1　仪器与试药
HP－1050 DAD高效液相色谱系统， 实验用甲醇为优级纯，异丙醇为分析纯，水为超纯水。仙茅苷对照品（批号771－9201）购自中国药品生物制品检定所，为薄层鉴别用，采用归一化法进行纯度检查，结果在本文的高效液相色谱条件下纯度为100%。仙茅药材购自各地药材公司，由中国药品生物制品检定所张继老师鉴定。
2　实验方法及结果
2.1　色谱条件　色谱柱：迪马公司Alltima C₁₈(5 μm,4.6 mm×250mm )；流动相：甲醇－异丙醇－水（20∶5∶75），流速1.0 mL^.min^-1；柱温：40 ℃；检测波长：283 nm。此条件下仙茅苷色谱峰的理论板数为4835，色谱图见图1。

图1　色谱图
A. 对照品　　　B. 仙茅药材
1.仙茅苷(14.58min)

2.2　色谱峰紫外光谱一致性比较及检测波长的确定　用二极管矩阵检测器分析了仙茅苷对照品色谱峰和仙茅样品中所测成分相应色谱峰的紫外光谱，结果紫外光谱基本一致，均在283 nm处有一最大吸收峰(见图2)，故确定检测波长为283 nm。
2.3　线性关系 精密吸取仙茅苷对照品溶液(0.1296 mg*mL^-1甲醇溶液) 2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，按上述色谱条件测定，记录峰面积的积分值，以仙茅苷进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。结果表明仙茅苷在0.25～2.59 μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为：
Y=651.53235X＋11.60048　r=1.0000

2.4　精密度试验　精密吸取上述对照品溶液，重复进样5次，记录对照品峰面积的积分值，计算得RSD为1.4 %。
2.5　回收率试验　精密称取已知含量的样品150～166 mg(含仙茅苷0.252～0.279 mg)，精密加入仙茅苷对照品0.297 mg，按样品测定方法项下试验，测定，计算回收率，结果平均回收率为99.67%，RSD为2.6%(n=4)。
2.6　样品测定　取本品粗粉（过40目筛）0.3 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇回流提取8 h，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液(0.12 mg^.mL^-1甲醇溶液)各10 μL，注入液相色谱仪中，测定，以外标法计算仙茅苷的含量。结果上海、西安、山东东营、北京（安国）、北京的药材中仙茅苷含量（％）分别为 0.168、 0.161、 0.222、 0.180、 0.208，n=3。
3　讨论
3.1　文献报道^［1］仙茅苷可溶于温水、甲醇、乙醇、正丁醇、醋酸乙酯等，实验中比较了甲醇、乙醇、醋酸乙酯作为溶媒的方法，结果以甲醇为最佳，故本文采用甲醇回流提取的方法。
3.2　实验甲醇－水、甲醇－水－醋酸系统作为流动相，但分离效果均不理想，故实验了甲醇－水－异丙醇系统，通过调节加入异丙醇的量，色谱峰峰形得以改善，故确定了上述色谱条件。实验中还比较了4种不同品牌的C₁₈色谱柱(Microsord-MVC₁₈、Platinum、Alltima及Kromasil C₁₈柱)，结果分离效果相近，说明此色谱系统有较广泛的适用性，可以作为仙茅品质评价的方法。
3.3　实验测定了购自5个产地的仙茅药材，色谱结果基本一致，仙茅苷含量相差不大，均在0.16 %～0.22 %之间。

作者单位：吴　禾　刘　云　陈玉敏　总后卫生部药品仪器检验所　北京　100071
本文于1997年10月17日收到

参考文献
1　徐俊平，董亲颐. 仙茅化学成分的研究Ⅰ.仙茅甙、苔黑酚葡萄糖甙的分离鉴定.中草药,1986,17(6):8
2　徐俊平，董亲颐. 仙茅化学成分的研究Ⅱ.新化合物仙茅素A的分离鉴定.中草药,1987,18(5):2
3　徐俊平，徐任生. 仙茅酚性甙成分研究. 药学学报，1992,27(5):353
4　王志伟，施大文，陈战地等. 薄层光密度法测定仙茅中仙茅甙的含量. 上海医科大学学报,1993,20(1):55