反相高效液相色谱法测定儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量*

　　摘要　目的：测定儿茶中主要成分儿茶素及表儿茶素的含量。
方法：采用反相高效液相色谱法，以儿茶素及表儿茶素为对照品。
结果：按选定的色谱条件，儿茶素及表儿茶素分别在0.256～1.28、0.728～3.641 μg范围内线性良好。2种成分的平均加样回收率分别为100.1 %和96.0 %，RSD分别为2.4 %和2.7 %(n=5 )。
结论：本方法操作简便、快捷，重现性好。

Study on Chemical Composition of Catechu—Quantitative Determination of Catechin and Epicatechin by RP－HPLC

Wang Gangli，Yu Jiandong，Tian Jingai and Zhang Ji
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050)

　　Abstract　Objective：To determine two components catechin and epicatechin in Catechu.Method:Using RP-HPLC with catechin and epicatechin as standards.Results:According to the selected chromatographic conditions, the linear range of these two compounds are 0.256～1.28 μg and 0.728～3.641 μg respectively.The average recoveries of catechin and epicatechin are 100.1 % and 96.0 %,RSD are 2.4 % and 2.7 % （n =5 ）, respectively.Conclusion:The method is easy and rapid, with good repeatability.
　　Key words　Catechu,catechin,epicatechin,RP-HPLC

　　　儿茶（Catechu）为传统药物，中国药典（1995年版一部）收载的儿茶为豆科金合欢属植物儿茶树Acacia catechu(L.) Willd. 去皮后的枝干煎汁浓缩而成的干燥浸膏^［1］，卫生部进口药材质量标准收载有除豆科儿茶外，还有茜草科钩藤属植物儿茶钩藤Uncaria gambier Roxb. 带叶嫩枝煎汁浓缩而成的干燥浸膏，商品上前者称为儿茶膏，后者称为棕儿茶^［2］。现有的药材质量标准中含量测定项均为测定儿茶中总鞣质的含量，操作繁琐，不能很好地控制药材质量。药理研究表明，儿茶素类化合物具有明显的清除体内自由基、阻断N-亚硝基化合物形成、抑制脂氧化酶活性和脂质过氧化物作用，并有防突变、防癌等药理活性^［3］。本文采用反相高效液相色谱法，按选定的色谱条件，同时测定豆科和茜草科（进口）儿茶药材中儿茶素(catechin)及表儿茶素(epicatechin)的含量。该法操作简便，灵敏度高，分离度好，适用性强，可用于检测和控制该药的内在质量。
1　仪器和试药
PE LC-200高效液相色谱仪；LC295紫外可见检测器；HP3295积分仪。
柠檬酸、N、N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃均为分析纯。
儿茶素对照品（纯度＞98 %）及表儿茶素对照品 (纯度96 %)购自Sigma公司。
2　分析条件的确定
2.1　色谱条件　色谱柱：Phenomenex ODS(2)柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)；理论塔板数按儿茶素计算大于3000。流动相：0.04mol^.L^-1柠檬酸-N,N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃（45∶8∶2 ），流速：0.8 mL^.min^-1。柱温：35 ℃。检测波长：280 nm。进样量：5～10 μL。灵敏度：6。在本色谱条件下，对照品与样品色谱图见图1。

图1　儿茶HPLC色谱图
A.对照品　B.样品
1.儿茶素　2.表儿茶素

2.2　线性关系试验　精密称取儿茶素对照品1.28 mg及表儿茶素对照品3.64 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，各吸取2、4、6、8、10 μL，进样测定，以对照品的含量X（μg ）对峰面积积分值Y作图，各得到一条直线。结果表明：儿茶素及表儿茶素分别在0.256～1.28、0.728～3.641 μg范围内线性关系良好，2种成分的回归方程分别为：

Y=6.111×10⁶X+2.5×10⁴　r=0.9999
Y=7.296×10⁵X-2.8×10³　r =0.9998

2.3　精密度考察　取同一样品溶液反复进样5次（每次5 μL）进行测定，计算。结果儿茶素、表儿茶素峰面积积分值的RSD分别为3.9 %、4.2 %。
2.4　重现性考察　取儿茶样品6份，每份0.02 g，分别精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（1∶1）40 mL超声20 min溶解，并以甲醇-水（1∶1）稀释至刻度，溶液过0.45 μm滤膜，精密吸取此溶液5 μL，进样，测定，计算儿茶素和表儿茶素的含量。结果儿茶素及表儿茶素含量的RSD分别为1.2 %、1.9 %。
2.5　回收率的测定　精密称取儿茶素对照品16.07 mg及表儿茶素对照品13.21 mg，置25mL容量瓶中，以甲醇-水（1∶1）超声溶解并稀释至刻度,摇匀即得对照品溶液。取已知含量的儿茶样品5份，每份0.01 g，分别精密称定，精密加入对照品溶液3 mL，按“2.4”项下从“置50 mL容量瓶中”起操作，进样10 μL，测得儿茶素及表儿茶素的平均回收率分别为100.1 %和96.0 %，RSD分别为2.4 %和2.7 %，n=5。
3　样品测定
取实验用样品各2份，每份0.02g，照“2.4”项下方法操作，进样5～10 μL，测定结果见表1。
4　讨论
4.1　提取方法的确定
提取溶剂的选择：虽然儿茶素及表儿茶素同为黄酮化合物，但它们的母核上连有5个酚羟基，增加了它们在水和强极性溶剂中的溶解度，而且儿茶药材本身为水煎液的浓缩浸膏，因而采用强极性溶剂提取。曾采用甲醇、水、甲醇-水（1∶1）作为提取溶剂，结果表明采用甲醇-水（1∶1）作为溶剂的提取效果最佳，并可将儿茶样品充分溶解。
提取方法的选择：由于儿茶素及表儿茶素为同分异构体，儿茶素经长时间加热易发生差向立体异构化反应^［4］，使表儿茶素向儿茶素转化。实验也表明，加热回流提取后提取液中的儿茶素含量较高，表儿茶素的含量较少。故采用室温条件下超声提取，避免了因加热对样品测定产生的影响。

表1　儿茶中儿茶素及表儿茶素的含量

编号

进样量
/μL

种类

来源

含量/%

儿茶素

表儿茶素

1

5

豆科

云南西双版纳

20.6

12.7

2

5

茜草科

云南药材公司

（进口）

25.4

1.86

3

5

茜草科

安国药市（进口）

33.0

2.71

4

5

茜草科

安国药市（进口）

25.6

2.98

5

5

豆科

海南

21.0

13.3

6

5

茜草科

云南药材公司
（进口）

24.6

2.18

7

10

豆科

药材自制

2.9

1.83

8

5

茜草科

江西樟树（进口）

21.8

1.92

9

5

茜草科

长沙制药二厂提供
（进口）

24.8

2.26

10

5

豆科

云南红河

18.6

11.2

11

5

茜草科

云南（进口）

26.2

2.94

12

5

豆科

云南

16.2

12.9

13

5

豆科

成都药材公司

11.6

7.56

14

5

豆科

云南思茅

19.2

14.2

15

5

茜草科

本所馆藏(进口
496025)

30.2

1.57

16

5

豆科

缅甸

15.2

10.5

17

5

豆科

缅甸

15.5

8.41

18

5

茜草科

友谊医院（进口）

22.4

3.84

19

5

茜草科

天坛医院（进口）

24.8

2.27

注：表中样品均经中国药品生物制品检定所中药标本馆张继主管药师鉴定

4.2　曾采用甲醇－水（28∶72，冰醋酸调pH至3.0），乙腈－0.1 %磷酸（20∶80） 等作为流动相，但分离效果不好，以0.04 mol^.L^-1柠檬酸－N,N-二甲基甲酰胺－四氢呋喃（45∶8∶2）为流动相，样品可以得到较好的分离。
4.3　由于儿茶素类化合物在加热条件下不稳定，我们曾对对照品溶液和供试品溶液的稳定性进行考察。结果表明：为保证测定工作的准确性，对照品溶液最好在制备的当天使用，如果测定工作不能在当天完成，应将对照品溶液在低温冰箱中保存（2～3 d）。但时间不宜过长，因长时间放置后，溶液颜色会逐渐变深（可能系由于化合物发生缔合反应所致）；由于供试品溶液的提取方法较为简单，测定周期较短（40 min），通常在1个工作日内可完成3～4批样品的测定，故对供试品采取的方法为制备的当天测定。
4.4　据从事儿茶产地加工的人员介绍：该药材加工方法系选用新鲜砍伐的植物树干，立即砍成碎块，加水煎煮8 h，浓缩水煎液后制成。如木材放置一段时间后加工，药材质量明显下降。表1中7号样品系我们选用陈旧木材（放置1年以上）按上述方法加工提取所制，其儿茶素类化合物的含量明显较其它样品低得多。可见儿茶素类化合物的含量与儿茶药材质量有着直接的关系。

*　本项研究由九五国家重点科技攻关项目资助(编号96-903-02-02)
作者单位：王钢力　于健东　田金改　张　继　中国药品生物制品检定所　北京　100050
本文于1998年5月26日收到

参考文献
1　中国药典. 1995.一部：6
2　卫生部进口药材质量标准. 1986
3　于健东，王钢力，田金改. 儿茶的化学成分及药理研究进展，中国中药杂志，1999，24(增刊)：页码待定
4　陆蕴如主编. 中药化学. 北京: 学苑出版社，1997.135