泽泻药材的质量标准研究Ⅰ泽泻中2种泽泻醇的HPLC测定法*

(南京中医药大学　南京　210029)

　　摘要　　采用高效液相色谱法以乙腈—水(65∶35)为流动相，测定了15种产地泽泻药材及13种市售饮片中泽泻醇A 24—乙酸酯、泽泻醇B 23—乙酸酯的含量，本法简便、灵敏，重现性好。
关键词：泽泻　泽泻醇A 24—乙酸酯　泽泻醇B 23—乙酸酯　高效液相色谱法
中药泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientalis(Sam.)Juzep.的干燥块茎，为利水渗湿之要药，神农本草列为上品。其中泽泻醇类成分泽泻醇A 24—乙酸酯、泽泻醇B 23—乙酸酯等具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝作用^［1］，为泽泻的主要活性成分，也为泽泻质量控制的主要指标。日本学者曾采用HPLC法测定了泽泻中泽泻醇(alismol)的含量^［2］，本文采用高效液相色谱法对道地泽泻样品及各地饮片中泽泻醇A 24—乙酸酯、泽泻醇B 23—乙酸酯的含量同时进行测定，方法简便，结果可靠，为泽泻药材的质量控制提供了可靠的实验方法。
1　仪器与试药
岛津公司LC—10AT型HPLC色谱系统；SPD—10A紫外检测器，CLASS—10A色谱工作站；H66025T型超声清洗机。
对照品的制备：泽泻粗粉13 kg用75 %乙醇渗漉，回收乙醇至10 %，得油状提取物。提取物上硅胶柱以石油醚—乙酸乙酯(10∶2，10∶5，2∶10)分为三部分。第二部分上硅胶柱以苯—丙酮(100∶5)开始梯度洗脱，500 mL为1个流份，每50个流份丙酮梯增5 %，300个流份后每20个流份丙酮梯增5 %，243～264流份得粗结晶1.2 g，经丙酮重结晶得结晶Ⅱ 350 mg，经IR、MS、¹H—NMR、¹³C—NMR图谱鉴定为泽泻醇A 24—乙酸酯。第一部分上硅胶柱以苯—乙酸乙酯(100∶5)开始梯度洗脱，500 mL为1个流份，每100个流份乙酸乙酯梯增5 %，221～235流份合并再上小柱，用氯仿—乙酸乙酯梯度洗脱，以TLC检测，收集目标流份，得结晶Ⅲ 260 mg，经IR、MS、¹H—NMR、¹³C—NMR谱鉴定为泽泻醇B 23—乙酸酯。两对照品经HPLC及TLC检验为单一成分。
乙腈为色谱纯(美国Fisher公司进口分装)，水为重蒸水。
泽泻药材采收于四川、福建、广西、广东、江西等省，经本校中药鉴定室陈建伟副教授鉴定为泽泻(Alisma orientalis Juzep.)的干燥块茎。
2　实验条件
2.1　色谱条件　色谱柱：YWG—C₁₈柱(4.6 mm×200mm)，粒径：5 μm；流动相：乙腈—水(65∶35)；流速：0.8 mL/min；检测波长：208 nm；ATTN：5；温度25 ℃。
2.2　样品提取条件的选择　采用不同有机溶剂(丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇)超声提取30 min，结果表明以乙腈提取的杂质少，提取率高。还进行了超声提取时间(15、30、45、60 min)和超声次数的比较，结果以乙腈超声提取2次，每次30 min为宜。
2.3　线性关系　精密称取泽泻醇A 24—乙酸酯、泽泻醇B 23—乙酸酯各2 mg，加乙腈定容至10 mL，得混合对照品溶液。精密吸取此溶液0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 mL分别置于10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。分别进样3次各10 μL，以对照品浓度C(μg/mL)对峰面积平均值A求出泽泻醇A 24—乙酸酯、泽泻醇B 23—乙酸酯的线性回归方程分别为：
A＝-0.647＋0.907C　r＝0.9999
A＝-0.788＋0.997C　r＝0.9999
结果表明，两组分浓度与峰面积平均值均呈良好的线性，线性范围均为2.0～110 μg/mL。
2.4　精密度和稳定性　对同一浓度的样品连续7次进样，以泽泻醇A 24—乙酸酯峰面积计算，精密度RSD＝0.86 %。每隔2 h进样，样品在24 h内稳定，其RSD＝1.6 %。
2.5　加样回收率　精密称取泽泻样品0.3 g共9份，3份作样品含量测定，3份加入混合对照品溶液0.20 mL，3份加入混合对照品溶液0.40 mL，按样品测定项下进行操作，计算回收率，结果见表1。

表1　加样回收试验结果(n=3)

加入量/
mg

回收率±RSD/%

泽泻醇A 24—乙酸酯

泽泻醇B 23—乙酸酯

0.04

98.03±2.28

99.17±1.66

0.08

96.90±2.06

99.43±2.33

2.6　样品测定　精密称取泽泻粉末(过80目筛)约0.5 g(同时另取本品粉末测定水分)，置10 mL具塞试管中，加乙腈10 mL，超声30 min，离心(3500 r/min)10 min，取上清液；残渣加乙腈10 mL同法再提取1次，合并清液，残渣加乙腈2 mL洗涤2次，合并清液定容至25 mL。过0.45 μm微孔滤膜后，进样5～20 μL，测定结果见表2。样品及对照品的色谱图见图1。
3　讨论
3.1　为确保色谱定性的准确性，除采用本文流动相外，曾以甲醇—水、乙腈—水(70∶30、60∶40)等作为流动相，进行了样品及对照品的定性比较，结果表明样品中均有与标准品一致的保留值。
3.2　对道地药材及不同产地饮片的测定结果表明，不同产地泽泻中泽泻醇A 24—乙酸酯及泽泻醇B 23—乙酸酯的含量差异较大。福建、江西泽泻中泽泻醇B 23—乙酸酯含量较高，而四川、广西泽泻中泽泻醇A 24—乙酸酯含量较高。为了更好地评价泽泻药材的质量，可考虑将2种成分同时作为泽泻的指标成分。

表2　泽泻样品的含量测定结果(%，n=3)

样品

样品产地

泽泻醇A
24—乙酸酯

泽泻醇B
23—乙酸酯

合计

药材

广西小　

0.0958(0.5)

0.0179(2.2)

0.114

广西大　

0.0945(0.6)

0.0078(2.4)

0.102

江西　　

0.0085(0.6)

0.166(0.4)

0.174

广东　　

0.0339(2.6)

——

0.0339

福建建瓯

——

0.103(0.3)

0.103

福建龙海

——

0.141(1.4)

0.141

福建同安

——

0.165(1.9)

0.165

四川灌县

0.0145(1.0)

0.283(0.8)

0.297

四川彭阳

0.0119(0.4)

0.221(1.1)

0.233

四川绵阳

0.0289(2.2)

0.0163(2.4)

0.0452

四川　　

0.0139(0.6)

0.0675(0.4)

0.207

广西武鸣

0.101(0.3)

——

0.101

四川南充

0.1168(0.1)

——

0.0117

龙海须根

0.0414(1.6)

0.198(1.3)

0.240

饮片

广西　　

0.0852(1.8)

——

0.0852

安徽　　

0.0568(2.0)

——

0.0568

福建　　

0.0145(2.7)

0.104(1.7)

0.1181

广东　　

0.0248(0.6)

0.0262(2.9)

0.0510

山东　　

0.0426(0.4)

0.0243(2.2)

0.0669

河南　　

0.0506(0.1)

0.0346(0.2)

0.0852

湖南1 　

——

0.204(0.2)

0.204

湖南2 　

0.0647(0.7)

——

0.0647

炒片

重庆　　

0.0141(0.6)

0.273(1.0)

0.287

烘片

亳州　　

0.0535(0.3)

0.0362(1.2)

0.0897

南京　　

0.0500(0.9)

0.112(0.2)

0.162

晒片

南京　　

0.0238(1.7)

0.0299(1.7)

0.0537

亳州　　

0.0248(0.9)

0.0170(0.1)

0.0418

注：括号内为RSD(%)

图1　泽泻样品及标准品的色谱图
A.混合标准品　B.福建泽泻
C.四川南充泽泻　D.四川饮片
1.泽泻醇A 24—乙酸酯(10.4 min)
2.泽泻醇B 23—乙酸酯(24.5 min)

3.3　福建泽泻根须不计，共26份样品，去大小2份样，平均含量0.121 %，若以-20 %为限制定含量下限，两成分含量之和应不低于0.0970 %。

参考文献
1　　Kato T,et al.Inhibitory effects and active constituents of Alisma Rhiaomes on vascular contraction induce by high concentration of KCl.Bull Chem Soc，Jpn,1994,67:1394
2　　Matsuda H,et al.Quantitative analysis of alismol in Alismatis Rhizoma.Shoyakugaku Zasshi,1988,42:147

(本文于1998年3月2日收到)

Quality Standard Study of Rhizoma Alismatis Ⅰ
—Determination of 2 Alisols in Alisma Rhizomes by HPLC

Wen Hongmei,Peng Guoping,Chi Yumei and Li Wei
(Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing,210029)

　　Abstract:Alisol A 24-acetate and alisol B 23-acetate in Rhizoma Alismatis were determinated by HPLC using acetonitrile-water(65∶35)as mobile phase.15 samples were from different sources and 13 samples from the market.The method is sensitive,repeatable and easy to operate.
　　Key words:Rhizoma Alismatis,alisol A 24-acetate,alisol B 23-acetate,HPLC

*国家科委“九五”攻关项目资助课题