高效液相色谱法测定促甲状腺释放激素含量

　　促甲状腺释放激素又名普罗瑞林，化学名：焦-L谷氨酰-L组氨酰-L脯氨酰胺。英文名：Thyrotropin-Releasing Hormone(TRH)。TRH主要作用是促进垂体前叶合成和释放促甲状腺素(TSH)，也能引起血清泌乳素(PRL)的释放。国内外研究表明TRH兴奋试验对甲状腺机能亢进，甲状腺机能减退的诊断和鉴别以及检测脑垂体前叶分泌TSH和PRL的储备功能均有价值。主要用于诊断甲亢和鉴别判断甲低的病变部位，检测垂体激素的贮备功能和判断垂体瘤，亦可用于肌肉萎缩和休克的治疗。
TRH(原料)收载于日本药局方(十一及十二版)，其冻干剂未见收载。为此我们参考文献资料并经实验建立了本品的高效液相含量测定方法。此法可靠易行。

1　仪器与试剂
美国Waters高效液相色谱仪，2010色谱管理系统，国产中科院大连化物所Spherisorb C₁₈ 5 μm ODS柱。
甲醇、乙腈：色谱纯，三氯乙酸：分析纯；TRH对照品：本公司提供，含量不低于99.5%；注射用TRH：我公司产品，批号920101～920105。

2　方法与结果
2.1　流动相的选择　据文献报道^［1，2］，多肽的HPLC分析多以三氟乙酸(TFA)与乙腈的适当配比作流动相，在HPLC分析时我们采用三氯乙酸(TCA)代替三氟乙酸，经比较选用0.05%。TCA－乙腈－甲醇(405∶95∶1)为流动相，结果见图1。C₁₈ ODS 5 μm柱，其理论塔板数大于5000，与其它杂质分离很好。说明该流动相系统是可行的。

图1　TRH含量测定HPLC系统适用性试验理论板数按TRH计算为5395

2.2　检测波长的选择　取适量TRH，用上述流动相稀释，以流动相作空白对照在190～400 nm处扫描，TRH具紫外末端吸收而无其它特征吸收峰。见图2。故我们采用214 nm作检测波长。

图2　TRH对照品紫外光谱扫描

2.3　ODS柱的选择　我们比较了美国SP公司的BP18柱与大连化物所的YWG C₁₈及Spherisorb C₁₈ 5 μm柱，后者有较高的塔板数，较之SP柱与YWG柱高出近10倍。故我们选择大连化物所的Spherisorb C₁₈柱。
2.4　线性范围　取TRH对照品，用流动相配制成每毫升含0.071、0.143、0.286、0.571、1.142 mg的对照品溶液，分别取10 μL注入色谱系统测定，以对照品浓度对峰面积回归，其回归方程为
Y=1.64e+07X+4.00e+5 r=0.9996
2.5　回收率测定　取不同批号的5支注射用TRH，用5 mL流动相溶解，取10 μL注入色谱系统进行测定；另分别取上述相同批号的1支粉针，加入TRH对照品0.375 mg ，流动相定容至5 mL，再取10 μL进色谱系统测定，计算回收率，平均回收率=99.6%，RSD=0.93%。
2.6　精密度　分别取0.250 mg^.mL^-1对照品溶液10 μL注入色谱系统，测定7次，RSD为0.75%。
2.7　样品(冻干粉针)的测定　每批样品取10支冻干粉针，每支精密加入流动相2.0 mL溶解后，取10 μL进行测定。同时实验表明：样品中辅料甘露醇对TRH测定无干扰。3批样品结果分别为102.8%，99.31%，100.9%。

3　结论
本方法改用三氯乙酸作洗脱剂，用与乙腈及甲醇的三元体系来分析TRH，结果表明其分析精密度、回收率均达到满意的效果，色谱理论塔板数大于5000。该方法满足中国药典附录色谱方法的要求。

作者单位：丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司　519020

参考文献

　[1]　Vigh G .Factors in fluencing the retension of insulins in reversed phase high performance liquid chromatographic systems.J Chromatogr，1982,236:51
[2]　郑如玉，刘锦慧.高效液相色谱分离多肽.生物化学与生物生理进展，1983，53：56

本文于1998年10月21日修改回