反相高效液相色谱法测定蒺藜类3种水解黄酮苷元的含量

　　摘要　
目的：研究蒺藜、中亚滨藜黄酮类成分的含量情况。
方法：采用反相高效液相色谱法，以槲皮素、山柰酚、异鼠李素为对照品，测定蒺藜、中亚滨藜果实等21个样品中上述3种水解黄酮苷元的含量。色谱柱Hypersil－ODS，流动相为甲醇-0.4 ％磷酸（37∶63），流速1 mL^.min^-1，检测波长360 nm。2种浓度槲皮素加样回收率分别为94.09 ％、98.32 %，RSD分别为1.0 ％、1.5 %,n=3。
结果：蒺藜中以槲皮素为母核的黄酮类成分含量最高，中亚滨藜中以异鼠李素为母核的含量最高；各个不同部位以叶中黄酮类成分的含量最高，茎次之，果实更次之；不同采集时间蒺藜地上部分黄酮类成分的含量以6月份采集的样品最高。
结论：蒺藜中黄酮类成分以6月份采集的地上部分含量最高，且通过比较，主要黄酮类成分的含量是主要皂苷类成分含量的1.5倍左右,应对蒺藜中黄酮类成分加以研究利用。中亚滨藜含有较大量以异鼠李素为母核的黄酮类成分，亦值得进行研究开发。

Determination of Three Hydrolytic Flavonoid Aglycones in Tribulus terrestris and Atriplex centralasiatica by RP－HPLC

Shi Qin,Yu Boyang,Xu Luoshan and Xu Guojun
(Department of Pharmacognosy, China Pharmaceutical University, Nanjing　210038)

　　Abstract　Objective：To investigate the quantity of the flavonoids contained in Tribulus terrestris L. and Atriplex centralasiatica Iljin.Methods:By reverse phase HPLC the quantities of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in the hydrolyzed solution of T.terrestris and A. centralasiatica,including fruit,root,leaf,stem and aerial part(collected in June,July, Aug.,Sept.,Oct.) were determined. The separation was performed on Hypersil－ODS column with methanol-0.4 % phosphoric acid (37∶63) as mobile phase.The flow rate was 1 mL^.min^-1.The wavelength for measurement was 360 nm. The recoveries for quercetin in two different concentrations were 94.09 % and 98.32 %,with RSD of 1.0 % and 1.5 % respectively.Results:The main flavonoid aglycone in A.centralasiatica was isorhamnetin and in T.terrestris it was quercetin. In various parts of these two plants the highest content of flavonoids was in the leaves. The aerial part of T.terrestris collected in June had the highest content of flavonoids comparing with those collected in the other months. Conclusion:The highest content of flavonoids contained in T.terrestris was in the aerial part collected in June.And the quantity of main flavonoids was about 1.5 times the quantity of main saponins. The results indicated that the flavonoids contained in T.terrestris and A.centralasiatica should be studied and developed and further used.
　　Key words　Tribulus terrestris L.,Atriplex centralasiatica Iljin,quercetin,kaempferol,isorhamnetin, RP－HPLC

　　中药蒺藜主治头痛、眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痛、目赤翳障、风疹瘙痒等症。中国药典(1995年版)收载为蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，习称硬蒺藜；藜科植物中亚滨藜Atriplex centralasiatica Iljin的果实在少数地区亦作蒺藜药用，习称软蒺藜。近年来，国内对蒺藜的药理作用及化学成分都进行了较多研究，认为其甾体皂苷类成分为治疗心脑血管疾病的有效成分，并已开发成药品上市^［1］，对此类成分的含量情况也有报道^［2］。蒺藜中还含有黄酮类成分^［3］，活性作用不可忽略，而其含量情况尚未见报道。本文采用反相高效液相色谱法对硬、软蒺藜及其不同部位的3种水解黄酮苷元槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）进行了定量分析，以期为进一步的研究开发提供信息。
1　仪器、试药与样品
仪器：HP－1090型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（DAD）；HP－3396A 型色谱数据处理机。
试药：槲皮素（含2个结晶水）、山柰酚、芦丁，均为Sigma公司产品。异鼠李素为自提取，经光谱鉴定，结构与异鼠李素相同；纯度分析表明异鼠李素含量达99 ％ 以上。石油醚（60～90 ℃）、甲醇、盐酸及磷酸均为分析纯；重蒸水（自制）。
样品：见表1。
2　色谱条件
色谱柱：Hypersil－ODS（5 μm，200 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-0.4 ％磷酸，梯度洗脱，0→20 min，甲醇由37 ％→59 ％；流速：1 mL^.min^-1；检测波长：360 nm；进样量：15 μL；灵敏度：0.1 AUFS；记录纸速：2 mm^.min^-1；色谱分析时间：20 min。

表1　实验样品

编号

样品

植物来源

产地

采收日期

1

果实

T.terrestris

不详

江苏商品(1995.4)

2

果实

新疆

1992.9

3

果实

宁夏

1992.9

4

果实

河南

1992.9

5

果实

河北

1992.9

6

果实

山东

1992.10

7

果实

山西

1992.9

8

果实

吉林

吉林商品(1993.5)

9

果实

不详

安徽商品(1993.8)

10

地上部分

新疆

1993.6

11

地上部分

1993.7

12

地上部分

1993.8

13

地上部分

1993.9

14

地上部分

1993.10

15

果实

陕西

1993.9

16

叶

1993.9

17

茎

1993.9

18

根

1993.9

19

果实

A.centralasia-

tica

新疆

1993.10

20

叶

1993.10

21

茎

1993.10

3　溶液的制备
3.1　对照品溶液的制备　取槲皮素约14 mg、山柰酚约5 mg及异鼠李素约5 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，溶液浓度分别为槲皮素134.8 μg^.mL^-1， 山柰酚42.60 μg^.mL^-1，异鼠李素51.90 μg^.mL^-1。 将此母液分别稀释1／2、3／10、1／10、1／25、1／75倍，得6个浓度梯度的对照品溶液。
3.2　样品溶液的制备　样品粉碎过40目筛，精密称取2 g，置索氏提取器中，加石油醚25 mL脱脂3 h，挥尽石油醚，然后加入甲醇20 mL及1.5 mol^.L^-1盐酸10 mL，沸水浴中加热回流2 h，冷却，用甲醇定量转入50 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。
4　线性关系考察
精密量取不同浓度的对照品溶液15 μL进样，色谱分离图见图1－A。记录峰面积，以对照品峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归分析，结果见表2。

图1　高效液相色谱图
A.对照品　B.硬蒺藜　C.软蒺藜
1.槲皮素(10.8 min)　2.山柰酚(14.4 min)3.异鼠李素(15.6 min)

表2　峰面积与浓度的线性关系(n=3)

苷元名称

回归方程

r

浓度范围/μg^.mL^-1

槲皮素

Y=-3.967×10⁴＋1.247×10⁵X

0.9999

1.797～134.8

山柰酚

Y＝4.431×10⁴＋ 1. 412×10⁵X

0.9999

0.5680～42.60

异鼠李素

Y＝3.480×10⁴＋1.339×10⁵X

0.9999

0.6920～51.90

5　最佳水解时间的选择
取1号样品按“样品溶液的制备”项下的操作步骤分别在不同加热回流时间(1、2、3、4 h)进行水解，制备样品溶液，进样15 μL测定。结果表明，水解2 h黄酮苷元的含量最高。
6　精密度与重现性试验
6.1　精密度试验　采用25 μL微量进样器，精密量取稀释3/10倍的对照品溶液15 μL进样，测量峰面积，共5次。结果槲皮素、山柰酚及异鼠李素的RSD分别为1.2 ％、1.2 ％、3.8 ％。
6.2　重现性试验　取1号样品，按照样品溶液制备方法同时制取5份供试溶液，各精密量取15 μL进样，测量峰面积。结果槲皮素、山柰酚及异鼠李素的RSD分别为2.4 ％、2.7 ％、1.0 ％。
7　稳定性试验
对照品及样品溶液避强光放置，每隔2 h测定1次，结果表明在6 h内均保持稳定，可进行测定。
8　加样回收率试验
取1号样品1.5、2.0 g，精密称定，分别加入芦丁0.3666、0.4888 mg，按照“样品溶液的制备”项下的方法制得供试溶液，测定含量，以槲皮素计算加样回收率，结果2种浓度溶液的平均回收率分别为94.09%、98.32%，RSD分别为1.0%、1.5 %，n=3。
9　样品测定
按照“样品溶液的制备”项下方法制取各样品溶液，分别精密量取15 μL进样，硬、软蒺藜色谱分离图见图1－B、C。按外标法，以峰面积计算各样品中3种水解黄酮苷元的含量，见表3。

表3　3种水解黄酮苷元含量测定结果

（×10^-2mg^.g^-1，n=2）

样品

槲皮素

山柰酚

异鼠李素

1^*

36.16(2.4)

9.512(2.7)

13.07(0.95)

2

33.20

7.538

11.28

3

18.24

6.173

12.28

4

15.37

5.168

10.68

5

9.664

2.657

11.83

6

10.88

4.355

9.575

7

7.939

2.631

9.986

8

8.739

4.463

10.75

9

7.306

3.563

11.00

10

159.4

35.02

18.34

11

150.6

33.03

17.43

12

96.97

20.05

16.54

13

91.44

18.01

15.81

14

74.27

14.08

16.37

15

13.54

4.905

6.403

16

63.30

27.04

6.674

17

30.49

2.593

8.643

18

3.517

1.554

2.289

19

5.173

2.998

27.57

20

16.57

4.528

57.48

21

6.028

3.301

47.34

* n=5，括号内为RSD（%）值

10　讨论
蒺藜中以槲皮素为母核的黄酮类成分含量最高；中亚滨藜中以异鼠李素为母核的黄酮类成分含量最高。蒺藜、中亚滨藜均以叶中黄酮类成分的含量为最高，茎次之，果实更次之。不同采集时间蒺藜地上部分黄酮类成分的含量以6月份采集的样品最高，随着月份后推，依次下降。不同产地蒺藜果实中黄酮类成分的含量差异较大，其规律性尚有待进一步探讨。
结合前人工作^［2］，可知蒺藜中皂苷及黄酮类成分均以6月份采集的地上部分含量最高，这为研究及生产中选择合适的材料提供了依据。且比较来看，主要黄酮类成分的含量是主要皂苷类成分含量的1.5倍左右,提示蒺藜中黄酮类成分不容忽略，应加以研究利用。中亚滨藜茎、叶中均含有较大量以异鼠李素为母核的黄酮类成分，亦值得进行研究。

*　国家“八五”攻关课题 No.85-920-01-01a
**上海第二医科大学化学教研室　上海　200025
致谢：本室董辉博士惠赠部分对照品。
作者单位：师　勤　余伯阳　徐珞珊　徐国钧　中国药科大学生药学研究室　南京　210038
本文于1997年12月30日收到

参考文献
1　钱本余.蒺藜研究概述.中成药，1990，12(11)：34
2　王艳,陆蕴如.刺蒺藜中皂甙的含量测定的研究.药物分析杂志，1991,11(2):70
3　Saleh NAM,Ahmed AA,Abdalla MF.Flavonoid glycosides of Tribulus pentandrus and T.terrestris.Phytochemistry,1982,21(8):1995