银杏叶制剂总黄酮醇苷HPLC测定方法对比研究

中国药品生物制品检定所　100050
　　银杏叶制剂作为动脉血管扩张药，用于动脉硬化及高血压所致冠状动脉供血不全，心绞痛，心肌梗塞，脑血栓，脑血管痉挛等症^［1］。银杏叶所含黄酮类组分为其重要有效成分^［2］。对其黄酮醇苷含量限度的控制，可直接反应产品质量。近年来，我国亦越来越重视银杏叶制剂的生产和应用，但各生产厂家所制定的质量标准方法各异，规格参差不齐。就黄酮类成分的含量测定方法而言，国内所采用的方法有紫外分光光度法^［3～5］和高效液相色谱法，因前者专属性较差，现多数厂家采用后者。液相法的样品前处理又有盐酸水解法^［6～8］和硫酸水解法^［9，10］，水解时间为30min、3h不等。对照品的使用上既有单用槲皮素的测定方法，也有以槲皮素、山柰素、异鼠李素为对照的测定方法。总黄酮醇苷的换算系数各标准规定亦不尽相同。本文对不同HPLC方法进行了比较，现将结果报道如下。
1　仪器与试药
岛津LC-6A高效液相色谱仪，C-R3A处理机，SPD-6AV检测器；上海必能信超声有限公司SB5200超声波震荡仪。硫酸、盐酸、磷酸、甲醇等试剂均为分析纯。银杏叶片为市售品。银杏叶浸膏粉由山东威海制药厂提供。槲皮素、山柰素、异鼠李素为本所定量用对照品。
2　试验条件及方法
2.1　色谱条件　色谱柱：Alltech Platinum C₁₈ 100A 5μm, 4.6mm×250mm；流动相：0.4%磷酸溶液-甲醇(1∶1)；流速：0.8mL/min；检测波长：360nm；柱温：35℃。
2.2　对照品溶液的制备　精密称取经五氧化二磷干燥48h的槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含0.03、0.03和0.02mg的混合溶液，作为对照品溶液。
2.3　供试品溶液的制备
2.3.1　取银杏叶片20片，研细，精密称取相当于总黄酮醇苷60mg的粉末适量(约1g)，精密加入甲醇20mL，超声处理20min，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液10mL，置烧瓶中，加甲醇10mL，再加硫酸溶液（4→100）20mL，沸水浴中加热回流3h，放冷，移至50mL量瓶中，加甲醇至刻度，作为供试液A。

图1　银杏叶片黄酮苷元HPLC图谱
A.对照品溶液　B.硫酸水解供试液A
C.盐酸水解供试液C
1.槲皮素　2.山柰素　3.异鼠李素

2.3.2　精密称取银杏叶浸膏粉150mg，加甲醇10mL，超声处理20min，加硫酸溶液（4→100）20mL，沸水浴中加热回流3h，放冷，移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试液B。
2.3.3　取银杏叶片20片，研细，精密称取相当于总黄酮醇苷30mg的粉末适量(约0.5g)，精密加入甲醇20mL，超声处理20min，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液10mL，置烧瓶中，加甲醇-25%盐酸（4∶1）混合液25mL，水浴加热回流30min，迅速冷却至室温，移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试液C。
2.3.4　精密称取银杏叶浸膏粉75mg，加甲醇-25%盐酸（4∶1）混合液25mL，水浴加热回流30min，迅速冷却至室温，移至50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试液D。
3　测定方法与结果
3.1　精密吸取对照品溶液和供试品溶液A各10μL，注入液相色谱仪，测定各组分峰面积积分值。按①法：以槲皮素为对照、②法：以槲皮素、山柰素、异鼠李素为对照，分别计算样品中槲皮素(Q)、山柰素(K)、异鼠李素(I)的含量比，结果见表1。两种方法所得结果分别以下述各式换算成总黄酮醇苷的含量：
Ⅰ.　2.23Q＋2.63K＋2.38I^［6］
Ⅱ.　2.51Q＋2.64K＋2.39I^［11］
Ⅲ.　(Q＋K＋I)×2.51^［11］
Ⅳ.　2.504Q＋2.588K＋2.437I^［9，10］
不同计算方法所得结果见表2。

表1　槲皮素(Q)、山柰素(K)、异鼠李素(I)含量比

样品

方法①
Q∶K∶I

方法②
Q∶K∶I

市售品1

2.7∶2.5∶1

2.2∶2.1∶1

市售品2

1.9∶2.2∶1

1.5∶1.9∶1

市售品3

1.7∶2.1∶1

1.4∶1.8∶1

表2　不同方法所得结果(mg/片)

1

2

3

4

S²

①Ⅰ

8.685

8.426

8.638

9.045

8.699

0.0661

①Ⅱ

9.144

8.861

9.024

9.452

9.120

0.0624

①Ⅲ

9.026

8.742

8.903

9.329

9.000

0.0616

①Ⅳ

9.087

8.804

8.966

9.394

9.063

0.0622

②Ⅰ

9.098

8.829

9.101

9.529

9.139

0.0838

②Ⅱ

9.529

9.250

9.487

9.938

9.551

0.0816

②Ⅲ

9.435

9.141

9.380

9.827

9.446

0.0809

②Ⅳ

9.490

9.197

9.436

9.884

9.502

0.0811

表1数据表明2种计算方法所得的3种黄酮醇苷的含量比不同；表2实验数据经t化极差q法多重比较^［12］，证明①Ⅰ与 ②Ⅱ、②Ⅲ、②Ⅳ及①Ⅲ与②Ⅱ之间有显著性意义；由苷元换算成总苷的计算方法之间无明显差异。t检验证明仅以槲皮素为对照（①法），较分别以槲皮素、山柰素、异鼠李素为对照（②法）所得结果略低(p<0.1)。
3.2　精密吸取对照品溶液和供试品溶液A、B、C、D各5μL，注入液相色谱仪，测定各组分峰面积积分值。以“3.1.1”中方法②Ⅲ计算样品总黄酮醇苷的含量,结果见表3。
4　讨论
4.1　除本文所列数据外，笔者还对其他生产厂家的同类产品测定结果进行了分析比较，结果表明①法所测得数据多数在标示量的下限。且①法和②法所得的3种黄酮醇苷的含量比均有差异，但由苷元换算成总苷的方法之间无明显差异。盐酸水解制备供试液，水解时间短，测得含量高于硫酸水解法，证明该法水解完全。

表3　不同水解条件总黄酮醇苷测定结果

样品

浸膏粉(%)

片剂(mg/片)

盐酸

硫酸

盐酸

硫酸

实　1

28.92

23.77

11.57

9.27

验　2

29.29

24.04

11.87

9.42

次　3

29.92

24.50

11.93

9.45

数　4

29.06

23.97

11.83

9.69

x

29.30

24.07

11.78

9.46

s²

0.1955

0.0953

0.0233

0.0302

t

19.37

20.05

p

<0.001(t_0.001,6=5.96)

4.2　建议银杏叶提取物、制剂总黄酮醇苷含量测定方法作以下几点修订：(1)供试液的制备采用盐酸水解30min；(2)对照品溶液采用槲皮素、山柰素、异鼠李素混合溶液；(3)总黄酮醇苷含量的计算采用3种苷元含量之和乘以平均换算系数2.51；(4)规定槲皮素、山柰素、异鼠李素3种苷的含量比。

参考文献

1　　罗顺德等.银杏叶药理作用研究进展.中医药学报，1995，6：48
2　　营　佳.银杏叶药用研究概况.中国生化药物杂志，1996，17（1）：44
3　　卫生部标准.WS-02（Z-1）-93
4　　山东省标准.鲁/WYB.39
5　　贵州省标准.黔卫药准字（1994）65号
6　　江苏省标准.苏卫药准字（92）2806-3号
7　　上海市标准.沪Q/WS-1-2084-93
8　　湖南省标准.（1995）湘卫药标字第66号
9　　浙江省标准.1978年
10　　广东省标准.粤Q/WS-2527-94
11　　A Hasler,et al.Identification and determination of the flavonoids from Ginkgo biloba by high-performance liquid chromatography.J Chromatogr,1992,605:41
12　　郑用熙编著.分析化学中的数理统计方法.分析化学丛书，科学出版社，1986，7（7）：150

(本文于1997年3月27日收到)