高效液相色谱法测定珍贝素及蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸的含量

总后卫生部药品仪器检验所　100071
珍贝素是由蜂王浆冻干粉、枸杞、牡蛎等药材组成的复方胶囊制剂，为控制内在质量，我们测定了其中主药蜂王浆中特有成分10-羟基-2-癸烯酸的含量。10-羟基-2-癸烯酸的含量测定方法文献报道有紫外分光光度法^［1］、GC^［2］法及HPLC^［3］法。本文用高效液相色谱法测定了制剂珍贝素及原料蜂王浆冻干粉中10-羟基-2-癸烯酸的含量。
1　仪器与试药
惠普HP 1050—DAD液相色谱系统。实验用甲醇为优级纯，超纯水，磷酸二氢钠、磷酸等均为分析纯。10-羟基-2-癸烯酸对照品(812—9201)购自中国药品生物制品检定所，按归一化法实验，纯度为100%。珍贝素样品、蜂王浆冻干粉由解放军军事医学科学院提供。
2　方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱为Microsorb MV^TM C₁₈(美国TSP公司)，5μm，4.6mm×250mm；流动相为甲醇—0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(1∶1)，0.1mol/L磷酸二氢钠溶液用磷酸调pH为2.4～2.6；柱温为室温；流速1.0mL/min；检测波长为213nm。
2.2　色谱峰紫外光谱的一致性及检测波长的选择　用二极管阵列检测器，分析了对照品色谱峰和样品中所测成分相应的色谱峰的紫外光谱，结果紫外光谱基本一致，且最大吸收波长均为213nm，故确定检测波长为213nm。
2.3　可行性实验　取珍贝素样品、蜂王浆冻干粉、10-羟基-2-癸烯酸对照品、按处方量制备的缺蜂王浆冻干粉的阴性对照样品，按样品测定方法提取，进样，绘制色谱图，结果见图1，珍贝素和蜂王浆冻干粉与10-羟基-2-癸烯酸色谱行为一致，不含蜂王浆的珍贝素阴性对照样品无干扰，理论板数按10-羟基-2-癸烯酸计为5790。

图1　色谱图
A.阴性对照样品　B.样品
C.对照品　D.蜂王浆冻干粉
1.10-羟基-2-癸烯酸(t_R=19.3min)

2.4　线性关系　精密吸取0.04mg/mL 10-羟基-2-癸烯酸对照品乙醇溶液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0μL，按上述色谱条件测定，记录峰面积的积分值，以积分值为纵坐标，对照品量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，10-羟基-2-癸烯酸在0.1～0.7μg范围内呈良好的线性关系。计算回归方程为：
Y＝4512.88X+43.63　r＝0.9996
2.5　仪器的精密度及方法的重现性　精密吸取上述对照品溶液，重复进样5次，记录对照品峰面积的积分值，计算RSD为1.60%。精密称取同批珍贝素样品各5份，按样品测定方法测定，计算RSD为1.66%(n=5)。
2.6　加样回收率实验　精密称取已知含量同批珍贝素样品5份，分别精密加入不同量对照品，按样品测定方法测定，计算回收率(结果见表1)。
3　样品测定
分别取珍贝素及蜂王浆冻干粉样品适量，精密称定，精密加乙醇50.0mL，超声处理(350W，35kHz)15min，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。分别精密吸取0.05mg/mL对照品乙醇溶液及供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪中，以外标法测定10-羟基-2-癸烯酸的含量。结果见表2。

表1　回收率测定结果(n=3)

加入对照品量
(mg)

实测值
(mg)

回收率
(%)

RSD
(%)

0.463

0.4801

103.7

0.37

0.926

0.8970

96.89

0.49

0.463

0.4561

98.51

1.08

0.556

0.5714

102.8

0.58

0.406

0.4074

99.68

0.75

表2　珍贝素及蜂王浆冻干粉中
10-羟基-2-癸烯酸的测定结果^*(n=3)

批号

含量

RSD(%)

珍贝素950220

3.17

0.98

珍贝素950210

3.20

1.01

珍贝素950217

3.05

0.67

蜂王浆冻干粉1

5.61

2.02

蜂王浆冻干粉2

5.42

0.52

蜂王浆冻干粉3

5.22

0.95

*珍贝素含量单位为mg/粒，冻干粉为%。
4　讨论
4.1　实验中考察了甲醇、乙醇、二氯甲烷及酸化后用二氯甲烷提取等样品前处理方法。结果表明，以乙醇直接提取为最佳，由于加热造成杂质溶出过多，故选择超声提取的方法，并考察了超声提取15、30、60、120min的含量情况，结果4种条件下含量测定结果基本一致，RSD＝0.9%，故认为超声处理15min即可提取完全。
4.2　实验中考察了多种流动相，提高流动相的酸性可以改善色谱峰的峰形，但pH太低不利于色谱柱的保养，故加入缓冲液，通过调节流动相的pH和缓冲液的浓度达到最佳的分离效果。结果表明，本法简便，准确可靠，重现性好。

参考文献

1　　张莉萍.蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸的含量测定.中国中药杂志，1990，15(6)：30
2　　吉　宁等.毛细管柱气相色谱法定量分析蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸.中草药，1990，21(9)：15
3　　陈康丽.人参蜂乳中10-羟基-2-癸烯酸的快速测定法.中成药，1990，12(6)：42

(本文于1997年8月7日收到)