高效液相色谱法测定连翘中连翘苷的含量

宁夏药品检验所　750004
中国药品生物制品检定所　100050

连翘系木樨科植物连翘Forsythiae suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果实。按采收时期不同，分青翘、老翘^［1］两种。连翘为传统常用中药，含有大量的木脂素类^［2～4］成分，测定方法虽有一些报道^［5，6］，但无法定检验方法。本文建立了HPLC法测定连翘的有效成分之一连翘苷的含量，经过大量试验，优化了提取分离方法及色谱测定条件，方法学考察表明，该法简便易行，重现性好。
1　仪器与试药
岛津LC—6A输液泵，SPD—6AV检测器，C—R3A数字处理机；岛津LC—10AD输液泵，SPD—10A二极管阵列检测器，CLASS—10A色谱工作站；连翘苷对照品：中国药品生物制品检定所；连翘药材：山西省药检所提供及河北安国药市购买，由中国药品生物制品检定所中药室鉴定。甲醇、乙腈等试剂均为分析纯。
2　色谱条件
色谱柱：Axxiom-ODS(4.6mm×25cm)；检测波长：280nm；流动相：乙腈—水(25∶75)；流速：0.8mL/min。理论板数以连翘苷计为5000。样品分离色谱图见图1。
3　色谱峰紫外光谱一致性比较
样品中所测成分色谱峰与连翘苷对照品色谱峰200～400nm紫外光谱比较，相似度(Similarity)为1.00(见图2)。
4　溶液的制备
4.1　对照品溶液的制备　精密称取经五氧化二磷干燥48h的连翘苷对照品适量，加甲醇制成0.25mg/mL的溶液。

图1　对照品(A)与样品(B)HPLC色谱图
1.连翘苷

图2　样品测定成分与对照品色谱峰紫外光谱
1.连翘苷　2.样品

4.2　供试品溶液的制备　精密称取连翘粉末约1g，精密加入甲醇15mL，密塞，称定重量，冷浸过夜。超声处理25min，放至室温，补足失重，滤过。精密吸取续滤液5mL，水浴蒸至约0.5mL，加中性氧化铝0.5g拌样后，蒸干，加于已处理好的中性氧化铝柱(100～120目，1g，内径10～15mm)上，用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并转入5mL量瓶中，定容，摇匀，过0.5μm微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。
5　线性关系的考察
分别配制连翘苷对照品浓度为0.098、0.197、0.288、0.393、0.501mg/mL的甲醇溶液，各精密吸取5μL注入液相色谱仪，测定。以连翘苷进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算回归方程为：
Y＝91239.1X-1054.9　r＝0.9995
结果表明：连翘苷在0.5～2.5μg范围内线性关系良好。
6　精密度与重复性试验
精密吸取对照品溶液6μL，重复进样6次，测得平均峰面积积分值为136648，RSD为0.4%，n=6；按供试品溶液制备方法处理同一批样品5份，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，进样测定，以外标法计算，结果连翘苷平均含量为4.23mg/g，RSD为1.8%，n=5。
7　加样回收率试验
精密称取已知含量的样品5份，每份0.5g，分别精密加入0.4164mg/mL连翘苷对照品甲醇溶液5mL，精密加入甲醇10mL，按与供试品溶液制备相同的方法进行处理，同项“6”法进样测定、计算，结果平均回收率为99.53%，RSD=1.06%(n=5)。
8　样品测定
取不同来源的连翘药材，按供试品溶液制备方法处理，同项“6”方法进样测定，计算，结果见表1。

表1　样品测定结果

来源

含量(mg/g)

青翘

安国药市1

2.30

安国药市2

5.25

山西沁源

4.23

老翘

山西安泽

0.15

河南洛阳

1.59

安国药市

1.64

9　讨论
9.1　样品制备曾采用加水沉淀法，以去除其它成分的干扰，但结果不甚理想，采用吸附柱层析法则大大提高了供试品溶液的纯净度。通过对氧化铝、氧化镁、大孔吸附树脂等柱的净化效果的比较，从中筛选出中性氧化铝柱；经对不同浓度的甲醇、乙醇溶液的洗脱效果作比较，结果以70%乙醇溶液为最佳。
9.2　曾选用甲醇—水(35∶65)、加入少量四氢呋喃作流动相，结果峰形不甚理想，采用乙腈—水后可有效地改善峰形，而且乙腈浓度的变化可明显影响连翘苷的保留时间。
9.3　样品测定结果表明：不同来源的连翘药材的连翘苷含量相差较大，而青翘中的连翘苷含量相对较高。

参考文献

1　　中国药典.1995.一部：145
2　　林启寿.中草药成分化学.北京：科学出版社，1977.115，345
3　　千叶真理子等.汉药レンギョウの成分研究(第3报)シナレンギョウおよびレンギョウ果实の成分について，生药学杂药学1978，32(3)：194
4　　西部三省等.汉方药レンギョウの成分研究(第2报).第九改正日本药局方レンギョウ基原植物の果实におけるリグナン配糖体成分の比较，药学杂志，1977，97(10)：1134
5　　梁文藻等.连翘成分分析Ⅰ.连翘甙和连翘脂素的分离鉴定和测定.药物分析杂志，1985，5(1)：1
6　　崔燕岩等.连翘有效成分的HPLC法测定.药学学报，1992，27(8)：603

(本文于1997年7月24日收到)