高效液相色谱法测定犬血浆和小鼠组织、体液中的紫杉醇

摘要 建立了犬血浆和小鼠组织、尿和粪中紫杉醇的HPLC检测法。生物样
品用乙醚提取后在C18柱上以0.01mol/L磷酸二氢钠-甲醇(40∶60，pH=4.3)
为流动相，安定为内标，检测波长为233nm条件下进行检测。线性范围为
18.7～3600μg/L，最低检测浓度为10μg/L。紫杉醇在犬血浆和小鼠肝、
尿、粪中的回收率分别为86.04％～91.73％，87.62％～92.12％，
86.78％～92.16％，79.83％～85.62％；日内RSD分别为2.33％～3.78％，
1.37％～4.55％，3.54％～4.28％，2.30％～4.06％；日间RSD分别为
3.31％～4.38％，4.72％～5.51％，6.75％～8.53％，4.43％～6.67％。
用本法对家犬iv紫杉醇后的药代动力学进行了研究，并报告了有关的动力
学参数。
关键词：紫杉醇 高效液相色谱法 血药浓度 药代动力学

紫杉醇(taxol)是从紫杉树皮中分离提取的天然产物，主要用于晚期卵
巢癌和乳腺癌的治疗。为了对紫杉醇的药代动力学进行研究，我们在文献
的基础上建立了简便、灵敏的HPLC-UV检测法以定量分析生物体液中的紫杉醇。

1 仪器与试药

　　SP高效液相色谱仪，配有SP-8810型恒流泵，SP-2000型紫外检测器和
SP-4600型数据处理仪。

紫杉醇对照品：纯度＞98％，由四川中药研究所提供；安定对照品：
中国药品生物制品检定所；紫杉醇注射液：由本所制剂研究室提供。

乙醚(AR)经重蒸后使用，甲醇、磷酸二氢钠、磷酸等均为AR试剂。

2  色谱条件

色谱柱：ODS2(C18)柱(100mm×4mm)，澳大利亚SGE公司；流动相：0.01mol/L
磷酸二氢钠-甲醇(40∶60，V/V)，用磷酸调节至pH=4.3，流速为1.0mL/min，
检测波长为233nm。

3  方法与结果

3.1  标准储备液的制备   取紫杉醇和安定适量，分别用甲醇配制成浓度为
3.6g/L和1.0g/L的标准储备液。精确吸取紫杉醇储备液，用甲醇依次稀释
为0.187～36mg/L的工作液，同法将内标液稀释为1.0mg/L。

3.2  样品的提取

血浆样品的提取：犬血浆1.0mL，加入内标液100μL和1mol/L碳酸氢
钠0.2mL，混匀，加5mL乙醚提取。乙醚层转移入锥形管中，在37℃水浴中
氮气吹干，残留物加100μL甲醇溶解，取10μL进样分析。

小鼠肝组织、尿和粪样品的提取：分别取小鼠肝组织匀浆(10％)、粪
匀浆(10％)和尿样各1.0mL，加入内标液100μL，同上法提取。

3.3  被测药物的确认   家犬血浆和小鼠肝脏样品提取物的色谱图见图1。由
图可见，该方法可较好地分离紫杉醇及其代谢产物，内源性杂质对测定无干
扰，具有较好的特异性。

3.4  灵敏度   在空白犬血浆样品中加入不同已知量的紫杉醇标准液，经提取
后测得紫杉醇的最低检测限为4ng(信噪比为3)，由方法的精密度确定紫杉醇
的最低检测浓度为10μg/L。

图1 犬血浆(A)及小鼠肝脏(B)提取液的色谱图

Ⅰ.空白提取液 Ⅱ.外加紫杉醇标准提取液　Ⅲ.给药后的提取液

1.安定 2.紫杉醇

3.5  标准曲线和线性范围　取不同浓度的紫杉醇对照品工作液各100μL，
分别用犬空白血浆、小鼠空白肝匀浆(10％)、粪匀浆(10％)和尿稀释至
1.0mL，使成终浓度为37.5、75、1200、2400和3600μg/L，加入内标液
100μL，同上法提取并分析。结果表明，在37.5～3600μg/L的浓度范围
内，紫杉醇浓度与HPLC的响应值(紫杉醇与内标峰面积之比)之间呈良好
的线性关系。回归方程分别为：
Y犬血浆=0.1678+2.6339X  r=0.9972
Y小鼠肝=0.0891+2.9176X  r=0.9981
Y小鼠粪=0.0382+2.7883X  r=0.9996
Y小鼠尿=0.0926+2.4508X  r=0.9995

3.6  回收率   分别取犬空白血浆和小鼠空白肝匀浆、尿、粪匀浆各1.0mL，
加入紫杉醇对照品工作液使终浓度为37.5、300和2400μg/L，同法提取后，
进样测定紫杉醇的峰面积，与同样浓度标准溶液直接进样得到的色谱峰面
积比较，计算紫杉醇的回收率，结果见表1。

3.7  精密度  取不同浓度的紫杉醇对照品工作液各100μL，分别用犬空白
血浆、小鼠空白肝匀浆(10％)、粪匀浆(10％)和尿稀释至1.0mL，使成终浓
度为37.5、300和2400μg/L，加入内标液100μL，同法提取并测定紫杉
醇的浓度，计算方法的日内和日间精密度。结果见表2。

表1 紫杉醇的回收率(n=4)

表2 分析方法的精密度(n=4)

3.8  紫杉醇在犬体内的药代动力学   家犬5条，雄性，体重(13.8±2.3)kg，
iv3.0mg/kg的紫杉醇，给药后分别在不同的时间点抽取静脉血3mL，肝素抗
凝，离心分离血浆。取血浆1.0mL，加入内标100μL，按上述方法提取测定
血药浓度。其平均血药浓度-时间曲线见图2。用3P87药代动力学程序对血药
浓度数据进行拟合，表明，家犬iv紫杉醇后，血浆药物浓度随时间的变化过
程符合二室开放模型(r＞0.999)，主要的动力学参数(n=5)：分布半衰期
(t1/2α)为(0.072±0.043)h，消除半衰期(t1/2β)为(2.01±0.20)h，表
观分布容积(Vc)为(0.343±0.123)L/kg，清除率(CL)为(1.20±0.37)L/(hkg)，
曲线下面积(AUC)为(2.75±1.02)hμg/mL。

图2 犬iv紫杉醇(3.0mg/kg)后的药-时曲线(n=5)

4  讨论

生物样品中紫杉醇的HPLC检测法，文献报道大多采用外标法，以Sep-Pak
小柱固相萃取或用乙腈提取后直接进样。在实际应用过程中，发现外标法稳
定性较差，影响精确度。而采用固相提取法，虽然有其简便快速的优点，但
费用较高，不适合大批量样品的处理。采用乙腈提取后，内源性杂质较多，
尤其在组织、尿及粪样品中，因而干扰测定。我们采用的方法操作步骤简单，
内源性杂质对测定无干扰，并能较好地分离紫杉醇及其代谢产物，准确性好，
因而适合大批量多种生物样品中紫杉醇的提取测定，已被用于紫杉醇的药代
动力学、组织分布及排泄的研究。

在实验中，我们还比较了几种溶剂对提取效率的影响，发现二氯甲烷对
紫杉醇的提取回收率小于50％，而乙酸乙酯虽然有较高的提取率，但内源性
杂质较多，干扰测定，所以上述2种溶剂均不适合。乙醚具有较高的提取率，
其较低的沸点又使提取液可较快地吹干，可以提高效率。

参考文献

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with ovarian cancer.Cancer Chemother Pharmacol,1993,33(1)：48

　　　　　　　　Determination of Taxol in Dog Plasma，Mouse Tissue,and Urine,Feces by HPLC

Ge Zhaoheng,Li Hua,Xue Junfeng and Wang Ning

(Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing，100850)

Abstract:A HPLC method was developed for the determination of taxol in dog plasma
and mouse tissue,urine and feces.All samples were extracted with diethyl ether and
separated on a C18 column with the mobile phase consisted of 0.01 mol/L NaH2PO4
buffer-methanol(40∶60,pH=4.3).The internal standard was diazepam.The detector
was set at UV 233nm.The linear range of the calibration curve was 18.7～3600 μg/L
and the minimal detectable concentration was 10μg/L.The recoveries of taxol in dog
plasma and mouse liver,urine,feces were 86.04％～91.73％,87.62％～92.12％,
86.78％～92.16％,79.83％～85.62％,respectively.The RSDs of within-day were
2.33％～3.78％,1.37％～4.55％,3.54％～4.28％,2.30％～4.06％,and RSDs
of day-to-day were 3.31％～4.38％,4.72％～5.51％,6.75％～8.53％,4.43％～6.67％,
respectively.    The method has been used in pharmacokinetic studies of taxol in dogs
after iv 3.0 mg/kg and their pharmacokinetic parameters were reported.
Key words：taxol,HPLC,plasma concentration,pharmacokinetics