HPLC测定血清中阿昔洛韦浓度的方法改进

(上海医科大学药学院药理教研室　200032)

　　摘要　　改良HPLC测定人及大鼠血清中阿昔洛韦浓度的分析方法。使用Waters高效液相色谱仪，μ-Bondapak C₁₈柱，流动相为甲醇—水(3∶97，V/V)，流速1.5mL/min，检测波长254nm，内标物为扑热息痛，血清样品采用甲醇去蛋白。阿昔洛韦血清浓度在0.05～1.6mg/L范围内与峰高呈良好线性关系，大鼠和人血清中相对回收率分别为93.31%及90.69%；最低检测浓度均为0.025mg/L；天内精密度分别为0.83%～2.00%及1.10%～2.58%；天间精密度分别为2.01%～5.90%及3.90%～6.27%。
关键词：阿昔洛韦　HPLC

　　阿昔洛韦(Acyclovir，简称Acy)为核苷类抗病毒药，它已成为治疗单纯疱疹病毒和带状疱疹病毒感染，特别是重症感染的首选药^［1］。本品血药浓度的测定虽已有HPLC方法报道^［2～6］，但尚不理想，如样品处理过程繁琐，流动相酸度偏高对仪器有损害等。为此，本研究对Acy的HPLC检测条件进行了较为系统的研究，流动相使用普通的甲醇—水体系，试剂价廉低毒，血清样品处理采用直接去蛋白法简便易行。本方法灵敏、精确，可供药代动力学研究及临床血药浓度检测之需。
1　仪器与试药
　　Waters 486系统、510泵、U6K进样阀、486紫外检测器；不锈钢柱250mm×5mm，固定相为μ-Bondapak C₁₈柱；台式平衡记录仪(XWT—104，中国上海大华仪表厂)；阿昔洛韦原料(纯度为99.5%)及内标物扑热息痛原料(Acetaminophen，简称Ace，纯度为99.5%)由上海医科大学药学院附属红旗药厂提供；甲醇、乙腈、高氯酸、磷酸二氢钾均为分析醇，水为3次重蒸。
2　实验条件选择
2.1　检测波长　根据文献资料^［2～6］选λ＝254nm为检测波长。
2.2　流动相的选择　选用甲醇—水体系进行研究。曾试验过甲醇—水(2∶98)、(6∶94)、(3∶97)及甲醇—不同pH的K₂HPO₄—KH₂PO₄缓冲液(2∶98)，结果流动相为甲醇—水(3∶97)时峰形好，Acy的t_R＝6min，Ace的t_R＝9min。加缓冲液以后，Acy和Ace的峰型均无改善，且盐易结晶析出，损害柱子。
2.3　提取溶剂的选择　分别用高氯酸、甲醇、乙腈、沉淀蛋白法处理血清样品，直接取上清液进样，结果：甲醇、乙腈沉淀效果良好，从经济价廉考虑，选用甲醇。
综上所述，Acy的HPLC测试条件如下：流动相为甲醇—水(3∶97，V/V)，流速1.5mL/min，检测波长λ＝254nm，AUFS＝0.05；血清样品处理：取血清样品0.1mL，置5mL尖底具塞试管中，加内标1μg，再加入甲醇0.2mL，旋涡振摇90s，3500r/min离心15min，吸取上清液10μL进样测定。
3　试验结果
3.1　分离度　按本法测得的色谱图所示，在所检测的大鼠和人血清中，Acy与Ace及血清杂质峰完全分离，分离度佳，见图1。

图1　大鼠(A)、人(B)空白血清及大鼠(C)
和人(D)空白血清加对照品的色谱图
1、3.血清杂质峰　2.Acy　4.Ace

3.2　特异性　大鼠灌服Acy 40mg/kg 2h后的血清提取液中，加入一定量的Acy甲醇标准液，测得的色谱峰与没有加入标准液的血清提取液完全重叠，且前者峰高高于后者，证明血清中分离所得化合物为Acy。
3.3　标准曲线　于0.1mL大鼠空白血清中分别加入一定量的Acy及Ace,Acy浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mg/L，按上述方法提取测定，以Acy与Ace的峰高比Y(h_Acy/h_Ace)对Acy浓度C作线性回归，得回归方程为：
Y＝0.0095+1.622C　r＝0.9998
同上制备人空白血清的Acy系列浓度，经测定其直线回归方程为：
Y＝-0.0253+1.043C　r＝0.9997
3.4　检测限　按色谱峰信噪比大于2为标准，Acy的最低检测限为1.6ng，在大鼠及人血清中最低检出浓度均为0.025mg/L。
3.5　回收率　在大鼠及人空白血清中，分别加入一定量的Acy及Ace，提取测定，测得的h_Acy/h_Ace与标准配制品的h_Acy/h_Ace之比，即为Acy的相对回收率；提取后的h_Acy与标准配制品的h_Acy之比即为Acy的绝对回收率。见表1。

表1　Acy在大鼠及人血清中的回收率
(±SD，n=3)

配制浓度
(μg/mL)

大鼠血清回收率
(%)

人血清回收率
(%)

相对

0.1

95.24±3.81

89.75±2.17

0.4

94.46±1.88

90.52±1.14

1.2

90.23±0.37

91.82±3.26

绝对

0.1

90.51±0.79

88.28±1.41

0.4

90.49±4.12

88.16±4.15

1.2

86.83±1.27

90.52±2.92

3.6　天内及天间精密度　制备大鼠及人空白血清的Acy溶液，其浓度分别为0.1、0.4、1.2mg/L血清，各加内标1μg，提取测定，1d内重复测定4次求得天内精密度，每天1次，重复测定4d求得天间精密度，见表2。

表2　Acy在大鼠及人血清中的
天内及天间精密度(RSD，%，n=4)

配制浓度

鼠血清

人血清

(mg/L)

天内

天间

天内

天间

0.1

2.58

6.27

2.00

5.90

0.4

1.86

3.60

1.60

3.88

1.2

1.10

3.90

0.83

2.01

4　讨论
从图1可见，内标及供试品均有一些拖尾，但不影响测定。方法学探索表明：阿昔洛韦浓度在0.05～1.6mg/L范围内与峰高呈良好线性关系，大鼠血清平均相对回收率为93.31%，人血清平均相对回收率为90.69%，天内RSD数均小于3%，天间RSD均小于7%，最低检测浓度为0.025mg/L，说明本法为测定血清阿昔洛韦浓度的简便、灵敏、可靠的分析方法。

*本校91级毕业生

参考文献

1　王慧英等.阿昔洛韦—一种抗疱疹病毒的特效药.新药与临床，1990，9(1)：19
2　Molochia AM.Improved liquid chromatographic method for acyclovir determination in plasma.J Liq Chromatogr,1990,13(5):981
3　李　端等.阿昔洛韦片剂和胶囊在人体的生物利用度.中国医药工业杂志，1992，23(4)：165
4　Smith RL,et al.High performance liquid chromatographic determination of acyclovir in serum.J Chromatogr,1985,343:203
5　张　驰等.反相高效液相色谱法测定人血浆中阿昔洛韦的浓度.药学学报，1993，28(8)：629
6　周美华等.反相高效液相色谱法测定阿昔洛韦胶囊在人体的药动学.中国医院药学杂志，1994，14(10)：437

(本文于1997年1月17日收到)

An Improved HPLC Method for the Determination

of Serum Acyclovir Concentration

Zhang Hongwei,Pan Jiahu,Wu Chao,Dai Xiaohua and Li Duan

(Department of Pharmacology,School of Pharmacy,Shanghai Medical University,200032)

　　Abstract:An improved HPLC method for the determination of Acyclovir(Acy)in serum was developed.A Waters HPLC instrument with μ-Bondapak C₁₈ column was used.The mobile phase was a mixture of methanol and water in a ratio of 3∶97(V/V)at a flow rate of 1.5mL/min，the detector was set at 254nm.Acetaminophen was used as internal standard.The serum sample was extracted by a methanol protein precipitation method.Serum concentration of Acy ranging from 0.05mg/L to 1.6mg/L showed good linear relationship with the peak ratio and the minimum concentration detected was 0.025mg/L.The average recoveries in rat and human were 93.31% and 90.69% respectively.The intraday precision was ＜3% and interday precision was ＜7%.
　　Key words:Acyclovir,HPLC