生物检定法与HPLC法测定重组人生长激素（rhGH）效价的相关性验证

(中国药品生物制品检定所　北京　100050)

　　摘要　　对生长激素的检定和质量控制的重要指标之一是效价测定，其传统经典的方法为在体生物测定法—体重法和胫骨法。随着基因工程技术的发展和质量标准的不断完善，对rhGH的效价测定已用理化分析方法代替生物测定方法。本实验通过对进口和国产的多批rhGH制剂和原料的效价的对比实验，证明生物测定和理化测定的结果基本吻合，具有良好的相关性，为理化测定最终代替生物测定提供了实验依据。
关键词：rhGH　生物测定　HPLC　相关性

　　人生长激素（hGH）过去由人脑垂体提取,其成分不单一^［1］，对其检定只能依赖生物测定─去垂体大鼠体重法^［2～4］和去垂体大鼠胫骨法^［5］。随着科学的进步，DNA重组生长激素（rhGH）产品日趋成熟，纯度已达95％以上，生产工艺和产品已趋稳定，人们不断研究用简单、快速、灵敏、精确的理化方法代替费时、误差大、损害动物的生物测定^［6,7］。现已载入BP（1993）^［8］和EP（1997）^［9］，并都明确规定必须用适当有效的增进生物生长的方法，来证明生产制造过程中的rhGH产品不得少于2.5IU/mg的生物活性，并由国家卫生行政机构批准执行。在此前提下常规生产中，rhGH的效价测定可用理化方法（HPLC）代替。本文通过对进口和国内生产的多批rhGH制剂和原料的效价进行了生物测定和理化测定，结果表明两法基本吻合，具有良好的相关性，为理化测定最终代替生物测定法提供了实验依据。
1　材料
　　标准品（S）：WHO第一次hGH国际标准品IS 80/505，4.4IU/amp，生物测定用。WHO第一次rhGH国际标准品IS 88/624，3IU/mg，2.0mg/amp,生物测定和理化测定用。
样品（T）：T₁—上海细胞所rhGH制剂；T₂—Saizen进口rhGH制剂；T₃～T₅—安徽安科生物高技术有限公司rhGH制剂；T₆—安徽安科生物高技术有限公司rhGH原料；T₇、T₈—永恒生物技术发展（北京）有限公司Met—rhGH制剂。
去垂体大鼠：清洁级Wistar雄性大鼠（本所动物繁育场），体重60～80g，施去脑垂体手术^［10］，恢复2周后使用。
岛津LC—10AD泵，SPD—10A紫外检测器，CR－7A积分仪，TSK－G2000SW柱（7.8mm×300mm），超纯水器。
2　方法
2.1　在体生物测定
按去垂体大鼠体重法^［8］和胫骨法^［11］进行，实验设计2×2法，剂距1∶4，高剂量0.1IU/mL，低剂量0.025IU/mL，选择合格去垂体大鼠，随机均匀分组，每组5～10只，每组颈部皮下注射0.5mL一种浓度的S或T，每天注射2次（间隔6h），连续6d，每天同一时间称体重，最后一次给药16h后称重，处死大鼠，计算反应值（净增重）Yi=△bw=bw_d - bw0。bw_d 为最后一次给药（给药4d或6d）16h后大鼠体重；bw 0为第一次给药时大鼠体重。
胫骨法时取上述大鼠胫骨，在胫骨近心端顶部中间沿矢状面切开，硝酸银染色法染色，在倒置显微镜下测定骨骺软骨带宽度（测微尺单位）。
数据统计：按中国药典1995年版生物统计方法，量反应平行线原理做实验可靠性测验，实验结果可靠者计算效价PT和平均可信限率FL（％）。
2.2　高效凝胶排阻色谱（SE-HPLC）　色谱条件为流动相0.395%碳酸氢铵溶液，流速0.6mL/min，柱温为室温，检测波长为214nm，将S与T分别用流动相配成1.0mg/mL的溶液，进样量20μL。测量S和T的峰面积，计算rhGH效价。
3　实验结果
3.1　准确性比较　用生物测定法（体重法和胫骨法）与SE-HPLC法测定rhGH进口制剂、国产制剂和原料，rhGH纯度均大于95％（见表1）。由表1可见两种方法有良好的相关性，其相关系数r＝0.9028，p<0.01，两种方法间相关有非常显著性意义。两法结果之间虽存在一定偏差（最大偏差21％），由于生物测定误差较大，EP（1987）规定生物测定含量限度为80％～125％，实验误差限度FL为64％～156％，故两法偏差在生物测定本身允许的误差范围内，生物测定的误差可由增加动物数或实验次数来减少，如T₁ SE－HPLC法的PT＝5.5IU/amp，生物测定n＝3增至8时合并计算后PT分别为5.9和5.2IU/amp，FL(％)分别为22和12；T₃ SE－HPLC法的PT＝4.6IU/amp，生物测定n＝3增至6时合并计算后PT分别为6.3和5.7IU/amp，FL(％)分别为24和21，可见生物测定误差减少后与HPLC所测结果更为接近，偏差减小，两种方法基本吻合。
3.2　精密度比较　我们用生物测定和SE－HPLC多次测定同一样品（T₁和T₃），见图1和表2。表1和表2显示，生物测定所得PT范围较大，误差大，而SE－HPLC所测PT范围窄，误差小，RSD在4％以内。图1中两法所得PT的离散度更为直观，HPLC法比生物测定法的离散度小，精密度高。

表1　生物测定和理化测定效价的比较^*

样品

生物测定

理化测定

两法效价
偏差(％)

PT
(IU/amp)

FL
(％)

n

PT^**
(IU/amp)

RSD
(％)

n

T₁

5.2^**

12

8

5.5

1.4

6

6

5.9

22

3

7

T₂

3.4^**

20

3

3.4

1.3

3

0

T₃

5.7

21

6

4.6

3.3

3

21

6.3

24

3

31

T₄

3.7

30

4

4.4

3.4

3

17

T₅

4.6

23

4

4.2

4.3

3

9

T₆^***

10.8

22

3

10.5

2

3

T₇

5.4

12

6

6.4

2

17

T₈

7.4

27

3

6.4

2

14

* 两法相关，r=0.9028，p<0.01，f＝6
** 所用标准品为rhGH IS 86/624，其它为hGH IS 80/505。
***PT单位为IU/mL

图1　生物测定法和SE-HPLC法测定rhGH（T₁）效价的离散度－*－为平均值

4　讨论
在体生物测定法即去垂体大鼠体重法和胫骨法是测定GH效价法定方法之一，本实验在以前工作的基础上^［10,11］，实验方法更加成熟，因大鼠和实验室均达到清洁级，故大鼠施去垂体手术后，简化抗菌和喂葡萄糖水等步骤，而去垂体大鼠合格率仍能达到60％左右，并且给药期未发现一只大鼠体重下降或死亡。实验成功率达到较高水平。尽管如此，也不可否认生物测定法有费时、费工、伤害动物、去大鼠垂体技术要求高，误差较大等弊病；而理化方法（HPLC法）有精密度高，简单、快捷、灵敏、用样量小等优点，并可分离rhGH活性成分和非活性杂质（hGH二聚体和多聚体）^［6,7］，能达到测定rhGH效价的目的，并且与生物测定结果有良好的相关性，两法基本吻合，为理化测定法取代生物测定法提供了十分重要的实验依据。

表2　精密度比较

实验
次数

生物测定结果
(IU/amp)

理化测定结果^**
(IU/amp)

T₁

T₃

T₁

T₃

1

8.1

4.7

5.5

4.7

2

4.7

7.6

5.6

4.4

3

6.7

5.3

5.5

4.6

4

6.6

1.1

5.5

5

6.6

2.6

5.4

6

4.8

3.7

5.6

7

4.2^**

8

7.8^**

平均效价

5.2 ^*

5.7^*

5.5

4.6

范围

4.2～8.1

1.1～7.6

5.4～5.6

4.4～4.7

RSD(%)

24

54

1

3

* 加权平均合并计算结果
**同表1
　　本工作得到本室闫安庄、应刚、齐卫红等人的协助，在此表示感谢。

参考文献

1　Bangham D R.Assay for human growth hormones.J Pharm Biomed Anal,1989,7(2):169
2　Evans H M,et al.The purification of the anterior pituitary growth hormone by fractionation with ammonium sulfate.Endocrinology,1938,22:483
3　Marx W,et al.Bioassay of the growth hormone of the anterior pituitary.Endocrinology,1942,30:1
4　Groesbeck M D,et al.Highly improved precision of the hypophysectomized female rat body weight gain bioassay for growth hormone by increased frequency of injections,avoidance of antibody formation,and other simple modifications.Endocrinology,1987,120:2582
5　EP.Human growth hormone for injection.1987.2nd Edn.Part Ⅱ.Fasc 11,556
6　Bristow A F,et al.Assay of rDNA growth hormone.Pharmeuropa,1991,3（special issue）:3
7　Bristow A F,et al.Collaborative study.Analysis of therapeutic growth hormone preparations:Report of an interlaboratory collaborative study on growth hormone assay methodologies.Biologicals,1992,20:221
8　BP 1993,Addendum 1994,Somatropin,1381
9　EP 1997,Somatropin,951
10　李湛君.DNA重组hGH的生物测定方法的探讨 Ⅰ去垂体大鼠体重增加法.药物分析杂志，1995，15(2)：3
11　李湛君.DNA重组hGH的生物测定方法的探讨 Ⅱ胫骨法.药物分析杂志，1995，15（2）：8

(本文于1997年3月20日收到)

The Relative Correlation of Bioassay and HPLC for
Recombinant DNA-derived Human Growth Hormone(rhGH)

Li Zhanjun,Yang Zhaopeng and Xu Kangsen
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing,100050)

　　Abstract:The potency for growth hormone(GH) is one of the important parameter in quality control.Historically,it depended on the use of in vivo bioassay.Today,it has been suggested that the in vivo bioassay of GH could be replaced with physico-chemical assay in routine control.Size-exclusion HPLC method was compared with GH bioassay in our laboratory.The potency of various rhGH preparations and materials from many manufacturers at home and abroad was determined by in vivo bioassay including weight gain and tibial width in hypophysectomized rat and size-exclusion HPLC to examine the relative correlation of the two methods.Experimantal results showed that the contents obtained by HPLC method is generally in agreement with the potency by bioassay.Based on the study,the bioassay of rhGH could be replaced with HPLC in routine control.
　　Key words:rhGH,bioassay,HPLC,relative,correlation