HPLC测定草豆蔻中山姜素、小豆蔻明的含量

 
(梧州543001 广西贺州地区药品检验所；¹542600 广西钟山县中医院)

摘要　目的：为评价草豆蔻的质量，建立其中山姜素和小豆蔻明的含量测定方法。方法：高效液相色谱法，用Shim-Pack CLC-ODS柱(5μm，150mm×6mm)以甲醇-水(80∶20)作流动相，流速1ml*min^-1，检测波长为300nm，外标法定量。结果：山姜素、小豆蔻明进样量在0.05μg～0.26μg范围内，进样量与峰高呈线性关系(r分别为0.9996，0.9998)。山姜素平均加样回收率为101.9%，RSD=0.18%；小豆蔻明平均加样回收率为100.0%，RSD=3.6%，n=5。测定5批草豆蔻样品，山姜素含量0.50%～1.45%，小豆蔻明含量0.07%～0.72%；草豆蔻果皮、茎叶、根茎中此2种成分的含量均在0.2%以下。结论：方法简便、可靠，可用于生药分析。

Quantitatve analysis of alpinetin and cardamomin in Alpinia katsumadai by HPLC

Rao Weiwen(Rao WW), Lin Yongde(Lin YD) (Hezhou Prefectural Institute for Drug Control, Wuzhou543001)

ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the analysis method for alpinetin and cardamomin and evaluate the quality of Cao-doukou (Alpinia katsumadai). METHOD: A HPLC method was deueloped by using a Shim-Pack CLC-ODS column(150mm×6mm). A mixture of methanol-water (80∶20) was used as the mobile phase with a flow rate of 1 ml per minute and the detection wavelength was set at 300nm. The contents were calculated by external-standard method. RESULTS:The standard curves for alpinetin and cardamomin were linear over the range of injected amount of 0.05μg～0.26μg(r=0.9996 and 0.9998, respectively). The average recoveries of alpinetin and cardamomin were 101.9%(n=5, RSD=0.18%)and 100.0%(RSD=3.6%), respectively. Results of analysis of 5 samples show the contents of alpinetin and cardamomin in the semens of Alpinia katsumadai were 0.50%～1.45% and 0.07%～0.72% respectively and their contents in the pericarp, stem leaves and rhizome were less than 0.2%. CONCLUSION：The mothod is convenient, reliable and can be used for analysis of crude drugs.
KEY WORDS　Alpinia katsumadai, alpinetin, cardamomin, HPLC

　　草豆蔻为姜科植物草豆蔻(Alpinia katsumadai Hayata)的干燥近成熟种子。具有燥湿健脾、温胃止呕功效；临床上用于治疗寒湿内阻，脘腹胀满冷痛，暖气呕逆，不思饮食^［1］。已知其主要含挥发油与黄酮类成分。丁杏苞等^［2］用GC-MS分析表明草豆蔻挥发油含α-蒎烯、对聚伞花素等40多个成分。中国药典1995年版已把挥发油含量作为草豆蔻的质量控制指标之一。草豆蔻中所含黄酮类成分有山姜素(alpinetin)、小豆蔻明(cardamomin)等^［3～4］，对其含量测定方法未见报道。为全面评价草豆蔻的质量，我们建立了其中山姜素、小豆蔻明的反相高效液相色谱测定法，并测定了5个草豆蔻样品(种子)以及草豆蔻植株不同部位中山姜素、小豆蔻明的含量，报道如下。

1　仪器与材料

　　岛津高效液相色谱仪LC-6A系列，C-R3A处理机；Shim-Pack CLC-ODS色谱柱(5 μm,150 mm×6 mm)；岛津265FW自动记录分光光度计。甲醇、乙醇、醋酸等均为分析纯试剂。山姜素、小豆蔻明对照品(中国药品生物制品检定所)。草豆蔻生药样品为作者采集、收集并鉴定。

2　色谱条件选择

2.1　流动相　用ODS柱比较了不同比例的甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-异丙醇-水等系统，根据被测成分的分离情况，选定甲醇-水(80∶20)作为流动相，用前超声脱气；流速1ml*min^-1。
2.2　检测波长　取山姜素、小豆蔻明的甲醇溶液分别测定紫外吸收光谱，测得二者的最大吸收波长分别为286，346 nm。为了便于同时测定，选二者的光谱交点波长300nm为检测波长。
2.3　柱效与分离度　在上述色谱条件下，山姜素和小豆蔻明的保留时间分别为4.0，6.3 min，二者分离度为8.5，理论塔板数分别为4500和7800。草豆蔻样品液在本条件下也得到较好分离，见图1。

3　对照品溶液制备

3.1　对照品溶液配制　取山姜素、小豆蔻明对照品各约10 mg，精密称定，分别加甲醇使溶解配成每1ml约含0.5 mg的溶液。精密量取上述两种溶液各1ml，置同一个10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液，每1ml含山姜素、小豆蔻明各约0.05 mg，备用。
3.2　对照品纯度标定　按上述色谱条件，取山姜素、小豆蔻明对照品溶液各6μl(相当于正常分析进样量的20倍)，分别进样层析，结果山姜素进样量3.3μg得单一色谱峰；小豆蔻明进样量3.1μg，其色谱图除主峰外，在山姜素对应的位置有一小峰，按峰面积归一化法计算，纯度为99.65%。

4　线性关系考察

　　用10 μl微量注射器分别进样混合对照品溶液1，2，3，4，5 μl，测定山姜素、小豆蔻明的峰高，计算得线性回归方程为：山姜素进样量(μg)=0.000 23×峰高+0.001 75，r=0.999 6；小豆蔻明进样量(μg)=0.000 203×峰高-0.000 674，r=0.999 8。结果表明，山姜素、小豆蔻明进样量在0.05 μg～0.26 μg范围内，进样量与峰高均呈良好线性关系。

5　提取条件试验

5.1　提取溶剂　取同一批草豆蔻粉末，按同一提取条件(取样量0.2g，溶剂50ml，水浴加热回流1.5h)，分别比较了甲醇、乙醇、氯仿的提取效果，结果表明3种溶剂的提取效率顺序为：乙醇＞甲醇＞氯仿，故选乙醇作提取溶剂。
5.2　提取时间　取同一批草豆蔻粉末，比较了不同回流时间的提取效果，结果表明，用乙醇作溶剂，提取0.5 h～2.5 h含量测定结果差异不显著，提取1.5h已足够，见表1。

表1　不同提取时间含量测定结果.%，n=2

时间/h

山姜素

小豆蔻明

0.5
1.0
1.5
2.0
2.5

0.51
0.50
0.54
0.53
0.54

0.72
0.71
0.72
0.73
0.73

5.3　样品溶液的制备　将草豆蔻样品粉碎过50目筛，取约0.2 g，精密称定，置150ml烧瓶中，加乙醇40ml，水浴加热回流1.5h，放冷，滤过，另取乙醇10ml分次洗涤烧瓶及滤器，洗液一并滤入提取液中，定容至50ml。精密量取滤液20ml置蒸发皿中，水浴蒸干，放冷，残留物加甲醇10ml分次溶解，滤入10ml量瓶中，加至刻度，摇匀，备用。

6　定量分析

　　取混合对照品溶液、样品溶液各3μl，按上述色谱条件，分别进样分析，测定山姜素、小豆蔻明的峰高，每份样品进样2次，取峰高平均值，按外标法计算含量。样品测定结果见表2。

7　精密度考察

7.1　进样精密度　取混合对照品溶液3μl，连续进样8次，所得峰高数据如下。山姜素：514，514，521，520，510，518，515，520；=516，RSD=0.75%；小豆蔻明：573，562，577，576，578，562，576，579；=573，RSD=1.2%。

表2　草豆蔻样品含量测定结果.n=2

编号

样　品　来　源

山姜素/%

小豆蔻明/%

1
2
3
4
5
6
7
8

广西藤县产
广西岑溪产
广西梧州市售品1
广西梧州市售品2
种子，广西梧州产
果皮，广西梧州产
茎叶，广西梧州产
根茎，广西梧州产

0.59
0.54
0.50
0.60
1.45
0.20
0.03
0.06

0.07
0.72
0.72
0.71
0.16
0.002
0.02
0.05

7.2　含量测定方法精密度　取同一批样品粉末，按含量测定方法重复测定5次，所得含量数据如下。山姜素(%)：0.50，0.52，0.53，0.49，0.48；=0.50，RSD=4.1%；小豆蔻明(%)：0.73，0.73，0.71，0.72，0.70；=0.72，RSD=1.8%。

8　加样回收率测定

　　取已测定含量的草豆蔻粉末，精密称取约0.1g，精密加入一定量的对照品溶液，按样品溶液制备方法操作并测定含量，计算回收率，重复测定5次，结果见表3。

9　讨　论

9.1　草豆蔻为较常用中药，目前临床应用多入汤剂，仅以挥发油含量作指标尚不能全面评价其质量。本实验建立的草豆蔻中山姜素和小豆蔻明HPLC测定法，操作简便，效果满意。

表3　加样回收率测定结果.n=5

被测
成分

编
号

样品含量
/mg

加入量
/mg

测得量
/mg

回收率
/%

平均回
收率/%

RSD
/%

山
姜
素

1
2
3
4
5
1
2
3
4
5

0.515
0.518
0.514
0.518
0.519
0.736
0.740
0.734
0.739
0.767

0.662
0.662
0.662
0.662
0.662
0.917
0.917
0.917
0.917
0.773

1.191
1.191
1.190
1.192
1.194
1.676
1.603
1.675
1.672
1.533

102.1
101.7
102.1
101.8
102.0
102.5
94.1
102.6
101.7
99.1

　
　
101.9

　
　
　
100.0
　
　

　
　
0.18

　
　
　
3.6
　
　

小
豆
蔻
明

9.2　实验发现草豆蔻样品溶液色谱峰峰高数据精密度优于峰面积，故以峰高值定量。在本色谱条件下测得山姜素、小豆蔻明的检测灵敏度分别为445，582mm*μg^-1(峰高/进样量)。如果分别以各自的最大吸收波长(山姜素286nm，小豆蔻明346nm)作检测波长，其检测灵敏度还可提高约1倍。
9.3　在样品溶液制备过程中，先取乙醇提取液水浴加热蒸干，残留物再加甲醇溶解，目的是除去草豆蔻挥发性成分，以消除其对测定的干扰。
9.4　从同一植株中不同部位的测定结果可见，草豆蔻中黄酮类成分主要存在于种子中，其它部位含量均较低。

参考文献

1　中国药典1995年版.一部.1995：213.
2　丁杏苞，仲英，左春旭，等.草豆蔻挥发油的GC-MS分析.中草药，1993，24(6)：293.
3　中国医学科学院药物研究所.中药志.第3册.北京：人民卫生出版社，1984：16.
4　毕培曦，江润祥，吴德邻.姜科药用植物的化学、药理和经济用途-(五)草豆蔻.中药材，1988，11(6)：44.

(收稿：1997-07-17)