HPLC测定复方蛇床子胶囊中的蛇床子素

 摘要　
目的：建立复方蛇床子胶囊中蛇床子素的含量测定方法，为该新产品提供质量控制标准。
方法：以体积分数为50%的乙醇为提取溶剂，超声振荡15min提取。色谱柱：Shimpack CLC-ODS(150mm×4.6mm,5μm)，保护柱：自填国产YWGC₁₈H₃₇(20mm×4.6mm，10μm)，流动相：甲醇-水-四氢呋南(70∶40∶5)，检测波长317nm，柱温35℃。
结果：方法回收率为98.52%(n=6)，精密度为RSD=1.44%(n=5)。
结论：本实验建立的HPLC可以方便地测定复方蛇床子胶囊中的蛇床子素，可以用于复方蛇床子胶囊的质量控制。

Determination of osthole in Fufanshechuangzi capsules by HPLC

Zhang Zhirong(Zhang ZR),Hu Haiyan(Hu HY)(School of Pharamacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)

ABSTRACT　OBJECTIVE：To determine osthole in Fufangshechuangzi capsules for the quanlity control of this new preparation.METHOD:The samples were treated by ultrasonic shaking for 15min with 50% ethanol as extraction solvant. The HPLC method was penformed on Shimpack CLC-ODS column(5μm,150mm×4.6mm) with a mobile phase of methanol-water-tetrahydrofuran(70∶40∶5).The flow rate of mobile phase was 1.0ml*min^－1.A guard-column was packed with YWGC₁₈H₃₇(20mm×4.6mm,10μm).The UV detection was made at 317nm.The column tempreture was 35℃.RESULTS:The recovery of this method was 98.52%(n=6).The method reproducibility was RSD=1.44%(n=5).CONCLUSION:The method could be used to control the quality of Fufangshechuangzi capsules.
KEY WORDS　Fufangshechuangzi capsules,osthole,HPLC

　　复方蛇床子胶囊由6味中药组成，其中蛇床子为君药之一。蛇床子中含蛇床子素，其为蛇床子的指标成分，而且其化学结构、性质均已十分清楚^［1］，故本品的含量测定选择蛇床子素为指标成分。由于该方由多种药材组成，组分复杂，采用一般方法难以分离测定蛇床子素，故本研究选用分离效果好、灵敏度高的高效液相色谱法为含量测定方法，并对其方法学进行了系统研究。

1　仪器、药品、试剂、色谱条件及方法可行性

1.1　仪器
　　LC-10A高效液相色谱仪，附SPD-7A紫外可见检测器及C-R7A数据处理机(日本岛津)，CQ—250型超声清洗器。
1.2　药品与试剂
　　蛇床子素对照品(中国药品生物制品检定所)按本实验方法测定，用归一化法计算出百分含量为(99.85±0.3)%(n＝4)。复方蛇床子胶囊为自制。甲醇、四氢呋喃为分析纯。流动相用水为超纯水。
1.3　色谱条件及方法可行性
　　色谱柱：Shimpack CLC-ODS(150mm×4.6mm,5μm)，保护柱：自填国产YWGC₁₈H₃₇(20mm×4.6mm,10μm)，流动相：甲醇-水-四氢呋喃(70∶40∶5)，检测波长317nm，柱温35℃。
由于处方组成复杂，未选择到合适的内标物，因此按外标法计算蛇床子素的含量。在质量标准草案规定的条件下测定，蛇床子素峰形对称，保留时间15min。因流动相配制，柱温等因素影响，不同日期测定的色谱图蛇床子素峰保留时间略有变化。
用无水乙醇配制蛇床子素对照品溶液，测得紫外可见吸收光谱图见图1，其最大吸收波长为211，249，260，321nm，为减少干扰峰，经预试选择317nm为检测波长。空白(缺蛇床子)样品、本品样品及蛇床子素对照品的色谱图见图2。由图2可见，蛇床子素无干扰峰，方法可行。

2　方法与结果

2.1　标准曲线的绘制
　　精密称取蛇床子素对照品适量，用乙醇溶解定容为100.0ml，作为贮备液。分别精取此贮备液，用乙醇稀释配制成浓度分别为1.414，4.242，7.070，9.898，12.726，15.554μg*ml^－1的系列对照液。分别精密吸取10 μl注入液相色谱仪测定。以峰面积积分值对进样量(μg)进行回归，得回归方程A=-2 580+1 795 024X,r=0.999 88(X为进样量，μg)。结果表明，进样量在0.014 14 μg～0.155 54μg范围内线性关系良好。由于标准曲线截距小，并考虑到在测定中流动相配制等因素的影响，在实际测定中可采用随行标准单点比较法计算供试品中蛇床子素的含量。
2.2　提取条件的研究
　　为了保证供试品中蛇床子素充分提取，采取同一批供试品分别对提取溶剂、方式及时间进行了试验。
2.2.1　供试品称量范围　称取不同量的供试品，按质量标准草案含量测定项下操作和计算方法测定蛇床子素的含量。结果表明称样量在0.3g～0.8g范围内，测得的蛇床子素的含量一致。故确定称样量为0.5g为宜。
2.2.2　溶剂选择　精密称取供试品约0.5g，加入10ml提取溶剂，摇匀，超声15min，离心(15000r*min^-1)。取上清液10μl注入液相色谱仪进行测定(乙醚为提取溶剂时，取上清液于水浴上挥干，加10.0ml甲醇定容，取10μl进样)。经对甲醇、体积分数为50%和80%的乙醇、乙醚作提取溶剂试验，结果表明以体积分数为50%的乙醇提取效果为佳。
2.2.3　提取方法　精密称取供试品约0.5g，加入体积分数为50%的乙醇10ml，分别用超声振荡、回流和冷浸3种方法提取，离心(15 000r*min^－1)。取上清液10μl注入液相色谱仪进行测定。结果表明以超声振荡法提取效果为佳。
2.2.4　提取时间　精密称取供试品约0.5g，加入体积分数为50%的乙醇10ml，分别超声振荡不同时间，离心(15 000r*min^-1)。取上清液10μl注入液相色谱仪进行测定，结果以超声振荡15min提取效果为佳。
2.3　回收率试验
2.3.1　空白加样回收试验　取空白样品(全处方缺蛇床子，按供试品生产工艺制得)约0.5g，精密称定。精密加入蛇床子素对照品溶液适量，按本实验方法测定，平均回收率为99.5%，RSD＝1.58%。结果见表1，可见空白加样回收率良好。

表1　空白加样回收试验结果

编号

空白样品量／g

加入蛇床
子素量／mg

测得量／mg

回收率／%

1

0.3407

0.10755

0.10955

101.9

2

0.3465

0.10755

0.10848

100.9

3

0.3712

0.21510

0.21134

98.3

4

0.3435

0.21510

0.21271

98.9

5

0.3219

0.32265

0.31845

98.7

6

0.3367

0.32265

0.31729

98.3

2.3.2　样品加样回收试验　取样品(含量0.10 089%)约0.5g，精密称定。精密加入蛇床子素对照品溶液适量，按本实验方法测定，平均回收率为98.5%，RSD＝2.68%。结果见表2，可见样品加样回收率良好。

表2　样品加样回收试验结果

编号

称样量／g

加入蛇床
子素量／mg

蛇床子素
总量／mg

测得量／mg

回收率／%

1

0.452 1

0.086 04

0.131 65

0.129 72

98.5

2

0.451 9

0.086 04

0.131 59

0.126 15

95.9

3

0.460 4

0.129 06

0.175 51

0.176 47

100.5

4

0.448 8

0.129 06

0.174 34

0.161 91

92.9

5

0.462 2

0.215 10

0.261 73

0.260 12

99.4

6

0.462 6

0.215 10

0.261 76

0.265 12

101.3

2.4　对照品溶液和供试品溶液稳定性考察
2.4.1　对照品溶液稳定性考察　分别以甲醇和乙醇为溶剂配制对照品溶液，置冰箱中保存，于不同时间分别取10μl进样测定，以归一化法计算蛇床子素的含量(%)，结果见表3，可见蛇床子素在乙醇中更稳定。蛇床子素的乙醇溶液在冰箱中可保存48h。

表3　蛇床子素溶液的稳定性.n=3

放置时间/h

甲醇液含量/%

乙醇液含量/%

0
3
5
9
12
22
36
48
72

100
100
99.2
98.5
97.5
96.2
95.2
93.1
90.1

100
100
99.8
99.0
99.0
98.9
98.7
98.1
97.6

2.4.2　供试品溶液稳定性考察　以体积分数为50%的乙醇为溶剂按以上确定的提取方法超声振荡提取供试品，经离心后的供试品溶液置室温下保存，于不同时间分别取10μl进样进行测定，以随行单点比较法计算蛇床子素的含量(%)，结果供试品溶液稳定性不太好，仅可在室温下放置2h。因此供试品溶液在配制好后必须在2h内测定。
2.5　测定方法精密度考察
　　取同一批号的样品，精密称取5份，按本实验方法分别进行测定，结果表明方法精密度良好(RSD=1.44%,n=5)。
2.6　样品含量测定结果
　　取研制的10批产品，各精密称取3份，按本品质量标准草案中含量测定方法分别进行测定，结果本品蛇床子素平均含量为0.007 97%，RSD=0.001 67%(n=10)。

3　讨　论

3.1　在色谱条件的选择过程中，曾试用了文献方法^［2～4］但均未获得满意的分离效果，用本实验方法的色谱条件可使蛇床子素峰得到完全分离，而且蛇床子素的保留时间适中。
3.2　在提取溶剂的选择过程中，用乙醚直接超声提取未测出供试品中蛇床子素，可能是乙醚与供试品粉末不润湿而致。后先加10ml蒸馏水振摇润湿，再加10ml乙醚超声提取，再如前文所述操作。结果在蛇床子素特征峰处有小峰，峰值明显低于体积分数为50%的乙醇超声的提取法，未再行计算，故选择体积分数为50%的乙醇作为提取溶剂。

参考文献

1　向仁德，傅晓红.蛇床子化学成分的研究.中草药，1984，15(9)：14.
2　郭文生，吕扬，杨青，等.利用主客体分子包结现象选择分离蛇床子有效成分的方法.药学学报，1994，29(11)：829.
3　刘国蕉，朱品业.蛇床子香豆素成分的高压液相色谱分离及鉴定.药物分析杂志，1985，5(5)：308.
4　程大敦，赵俊.蛇床子中香豆素类的含量测定.药物分析杂志，1987，7(1)：112.

（收稿1997-11-06）