HPLC法测定人血清中氨甲喋呤血药浓度

摘　要：目的：建立反相高效液相色谱法测定血清中氨甲喋呤浓度的方法。方法：以甲醇∶醋酸盐缓冲液为流动相，茶碱作内标，检测波长为306nm。结果：在0～8μg^.ml^-1范围内呈良好线性关系，r=0.9999。日内及日间测得RSD分别为3.66%，4.03%。平均回收率为95.7%，血清中最低检测浓度为50ng^.ml^-1。结论：本法具有快速、准确，操作简便，流动相成本低等优点。

Determination of MTX in human serum by HPLC with UV Detector

ZHANG Qiang　XU Li-Ting　XIE Jing-Wen　JIA Zheng-Ping
（General Hospital of Lanzhou Command of PLA.Lanzhou　730050，Gansu）

ABSTRACT：Aim To establish a HPLC method for the Determination of MTX in human serum.Methods Theophyline was selected as in ternal standard.The UV detector was set at 306 nm.The mobil phase consisted of m ethanol and 0.05 M HAC-NaAC buffur (30:100).Results the detecti on limit was 50ng^.ml^-1.The good linearity was from 0 to 8 (g^.ml^-1. The average recovery was 95.7%.Within day and between days were 3.66% and 4.03% respectly. Conclusion this method is sensitive,rapid accurate,i nexpensive enough to be used for clinical therapeutic drug monitoring.
KEY WORDS：HPLC;MTX;Human serum

　　氨甲喋呤(Methotrexite;MTX)为抗肿瘤药，属二氢叶酸还原酶抑制剂。用大剂量MTX化疗后以甲酰四氢叶酸钙解毒治疗骨肉瘤有一定价值，临床已广泛应用。为了避免此疗法出现的严重的毒副反应，进行MTX的血药浓度监测，以指导救援剂甲酰四氢叶酸钙的合理应用是国际上公认的措施。目前，常用的监测方法为荧光偏振免疫测定法^［1］，但价格昂贵，增加病人的经济负担。为此，本文建立了测定血清中MTX浓度的高效液相色谱法。

1　药品与试剂

　　注射用MTX(连云港恒瑞制药有限公司，批号 980217)；MTX、茶碱标准品(均由中国药品生物制品检定所提供)；甲醇，色谱纯(山东省禹王实业化学总公司)；高氯酸，冰醋酸，醋酸钠为分析纯；水，重蒸馏。

2　仪器与色谱条件

2.1　仪器　日本岛津LC-6A型高液相色谱仪(日本岛津制作所)；SPD-6AV紫外可见检测器；CR-3A数据处理仪；超声波振荡器(上海超声波仪器厂)；离心机(美国雅培公司)。
2.2　色谱条件　色谱柱：1Zorbax ODS 4.5×15mm；流动相：甲醇： 0.05mol^.L^-1醋酸-醋酸钠缓冲液(30∶100)；流速：0.8ml/min；纸速：2mm/min；检测波长：306nm；灵敏度：0.01。

3　方法与结果

3.1　标准溶液的配制　取MTX适量，精密称定，配制成0.1mg^.ml^-1的甲醇液作为标准溶液；另取茶碱，精密称定，用甲醇配成1mg^.ml^-1的甲醇液作为标准溶液；另取茶碱精密称定用甲醇配1mg^.ml^-1甲醇液作为内标液。
3.2　血清样品处理　血清500μl，加入MTX标准液(0.5mg^.ml^-1)20μl，内标液50μl(0.5mg^.ml^-1)混合后，加入6%高氯酸至1ml。振荡，摇匀，10 000r/min离心5min。吸收上清液20μl进样，色谱分离见图1，MTX与茶碱出峰时间分别为10min、7min。

图1　氨甲喋呤的HPLC色谱图
A 空白血清　B 血清样品

3.3　血清标准曲线　取标准血清500μl,加入MTX标准液(0.1mg^.ml^-1)0、5、10、20、40、80μl，各加入茶碱内标液50μl，按3.2项方法处理，以氨甲喋呤与氨茶碱的峰高比对氨甲喋呤的浓度进行回归，得到0～8μg^.ml^-1标准曲线，回归方程为：
y=-0.06193+1.4826x　r=0.9999
式中y为样品与内标峰高比值，x为MTX的浓度，最小检测浓度为50ng^.ml^-1，信噪比为3∶1。
3.4　精密度试验　取室白血清0.5ml，加MTX标准液40μl，按上述方法提取测定8次，平均测得率99.0%，RSD为2.1%。重复性良好。
3.5　回收率实验　取标准空白血清0.5ml，分别加入MTX标准液(0.1mg^.ml^-1)5、20和80μl，按上述方法提取测定5次，计算回收率，结果见表1。

表1　血清中MTX的回收率(n=5)

加入量
(μg^.ml^-1)

测得量
(μg^.ml^-1)

回收率
(%)

平均回收率
(%)

RSD
(%)

0.5

0.48

96.0

2.0

1.78

89.0

95.7

3.66

8.0

8.16

102.0

3.6　方法稳定性试验　分别取标准空白血清0.5ml，分别加入MTX标准液(0.1mg^.ml^-1)5、20、80μl。按上述方法提取测定4次，日内差与日间差结果见表2、表3。

表2　MTX的日内精密度(n=4)

加入量
(μg^.ml^-1)

测得量
(μg^.ml^-1)

(%)

RSD
(%)

0.5

0.48

2.0

1.78

95.67

3.66

8.0

8.16

表3　MTX的日间精密度(n=4)

加入量
(μg^.ml^-1)

测得量
(μg^.ml^-1)

(%)

RSD
(%)

0.5

0.48

2.0

1.72

94.22

4.03

8.0

0.48

8.07

3.7　血药浓度测定　患者A，男，24岁，骨肉瘤，静脉滴注MTX1g,6h滴完。静滴完毕后，每6h给予甲酰四氢叶酸钙解毒。在静滴完毕后0、0.5、1、2、6、12h分别采静脉血测血药浓度，依次为：25.51、10.36、7.45、1.70、1.07、0.12μg^.ml^-1。患者B，男，20岁，静滴1gMTX后，于0、1、6、12h采血后测血药浓度，分别为24.59、11.92、2.08、0.61μg^.ml^-1，均未超出中毒浓度^［2］。

4　讨　论

　　本法采用C₁₈反相柱和成本较低的甲醇-醋酸盐流动相，MTX与茶碱获得满意的分离效果。高氯酸作沉淀剂，方法简便易行，可作为临床MTX血药浓度的快速测定。

(本文编辑　刘贺之)

作者简介：张强，男，1972年7月出生。学士，药师。
作者单位：张强（中国人民解放军兰州军区总医院药材科　甘肃　兰州　730050）
徐丽婷（中国人民解放军兰州军区总医院药材科　甘肃　兰州　730050）
谢景文（中国人民解放军兰州军区总医院药材科　甘肃　兰州　730050）
贾正平（中国人民解放军兰州军区总医院药材科　甘肃　兰州　730050）

参考文献：

［1］　Rosen G,Caparros B,Huvos A,et al.Preoperation chemotherapy fo r osteogenic sarconma,Selection of postoperative adjuvant chemotherapy based on the response of the primary tumor to preoperative chemotherapy［J］.cancer,1 982;49:1221
［2］　徐峰，徐静，何杏，等.大剂量氨甲喋呤的药代动力学［J］.第一军医大学 学报，1992；14(2)：138

收稿日期：1999-06-07
修回日期：2000-01-05