高效液相色谱法测定血清和尿中司帕沙星的药物浓度

　　摘　要　

目的：建立测定血清和尿液中司帕沙星的反相高效液相色谱法。

方法：用HPLC法测定了4例患者单剂量口服司帕沙星后血清和尿中药物浓度。

结果：司帕沙星色谱保留时间T_R为8.33min。在0.05～2mg^.L^-1和0.1～4mg^.L^-1范围内,血清和尿药物浓度与色谱峰高呈良好线性相关。

结论：建立了测定体内司帕沙星药物浓度的方法，为药代动力学的研究和临床药物监测提供了依据。
关键词　司帕沙星；含量测定；高效液相色谱法

DETERMINATION OF SPARFLOXACIN IN SERUM AND URINE BY A HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD

Liang Zhu，Pan Hanqing，Yuan Cheng，Wang Xiuying，Wang Jingxiang
(General Hospital of Jinan Military Region of PLA，Jinan　250031)

　　Abstract　AIM:To developed a reversed phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC) method for the determination of sparfloxacin in serum and urine.METHODS The sparfloxacin’s concentrations in four patients’ serum and urine were determined and the pharmacokinetics parameters were computed after a single oral of 400 or 200mg sparfloxacin tablet.RESULTS The chromatography retention time of sparfloxacin was at 8.33min. The standard curve was linear in the concentration range of 0.05～2mg^.L^-1 in serum and 0.1～4mg^.L^-1 in urine. CONCLUSION The results showed this RP-HPLC method was good for determining sparfloxacin in body fluid.
　　Key words　sparfloxacin；determination；high performance liquid chromatography

　　司帕沙星(sparfloxacin)为新一代氟喹诺酮类抗菌药物,其作用机理为抑制DNA合成时DNA旋转酶的作用,从而具有杀菌作用;其抗菌谱较宽,且对于环丙沙星耐药的菌株仍具有较强的作用^［1、2］。该药物的体液浓度测定现在国外报道的均为高效液相色谱-荧光检测法^［3、4］。为观察司帕沙星在各种病理条件下体内的药代动力学及生物利用度,建立了体液中该药物的高效液相色谱-紫外检测法,为药代动力学的研究和临床有效治疗提供依据。

1　材料和方法
1.1　药品与仪器　司帕沙星片及对照品(山西大同天丰药业有限公司,批号980305;对照品纯度99.5%);甲醇为色谱纯,其余有关试剂为分析纯。高效液相色谱系统，510泵-490E检测器-Baseline 810工作站(日本Waters公司),色谱柱及预柱(中科院大连化学物理研究所);2101-PC紫外分光光度仪(日本Shimadzu公司);AT-130色谱柱保温装置(天津科学仪器公司)。
1.2　色谱条件　柱填料Spherisorb C₁₈(5μm,4mm×150mm,45℃),预柱填料YWG C₁₈;流动相为50%甲醇水溶液,内含0.68g^.L^-1磷酸二氢钾和0.2g^.L^-1庚烷磺酸钠,并用磷酸调pH至3.0,流速1.2ml^.min^-1［5］;检测波长298nm(经190～600nm紫外扫描光谱确定),检测灵敏度0.005Aufs。
本条件下有关样品的色谱图见图1。司帕沙星的保留时间为8.33min,并与体液中杂质分离良好。

图1　司帕沙星(1)血(A)、尿(B)样品色谱图

1.3　标准曲线制备　精密称取司帕沙星对照品5mg,用50%甲醇溶液(pH=3)溶解并定容至25ml。精密量取此液0.5ml,再用甲醇定容至10ml,作为对照品贮备液。分别精取贮备液适量,氮气流吹干,分别加入正常人血清0.5ml或尿0.5ml,制成含司帕沙星0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5和2.0mg^.L^-1的系列浓度血清溶液和0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mg^.L^-1的系列浓度尿溶液。血清样品混合均匀后分别加入二氯甲烷5ml,3 000r^.min^-1离心5min, 取有机相4ml在45℃水浴用氮气流吹干,残渣用流动相50μl重组后进样20μl测定。尿样品用2倍量乙腈稀释和沉淀蛋白,3 000r^.min^-1离心4min后，取上清液20μl进样。用Baseline 810色谱处理系统进行线性回归得标准曲线方程。
在0.05～2mg^.L^-1和0.1～4mg^.L^-1范围内,体液药物浓度C与色谱峰高H呈良好线性相关,血、尿工作方程分别为
C＝0.336 7H×10^-6＋0.020 2，γ＝0.999 7
C＝0.520 1H×10^-7＋0.083 4，γ＝0.999 5。

2　结　果
2.1　加样回收率试验　取测定后的血、尿样品,分别加入司帕沙星对照品溶液适量,使浓度分别为0.1、0.5、1.5mg^.L^-1(血)和0.5、1.5、3.0mg^.L^-1(尿)。各配制5份,分别依法处理测定,求得加样回收率，结果见表1。

表1　司帕沙星加样回收率结果(n＝5,±s)

样品

加样浓度
(mg^.L^-1)

测得浓度
(mg^.L^-1)

回收率
(%)

平均回收率
(%)

血清

0.1

0.0953±0.0047

95.30±4.93

0.5

0.4741±0.0201

94.82±4.24

94.57±4.44

1.5

1.4039±0.0583

93.59±4.15

尿

0.5

0.4780±0.0222

95.60±4.64

1.5

1.3793±0.0458

91.95±3.32

93.87±3.86

3.0

2.8216±0.1084

94.05±3.61

2.2　重现性与检测限　以全系列对照样品溶液进行重现性考察，分别将标准曲线项下全系列浓度的血、尿对照样品重复5次进样,求得日内误差;连续进样5d,求得日间误差。结果见表2。

表2　方法重现性考察结果(n＝5,x±s)

样品

时间

斜率

RSD(%)

截距

RSD(%)

血清

日内

0.3367±0.0131

3.89

0.0202±0.0011

5.45

日间

0.3358±0.0172

5.12

0.0208±0.0014

6.73

尿

日内

0.5201±0.0213

4.10

0.0834±0.0043

5.16

日间

0.5225±0.0282

5.40

0.0846±0.0063

7.45

　　按信噪比(S/N)＝3计算方法的最低检测限，血清和尿司帕沙星最低检测浓度均为5μg^.L^-1。
2.3　体内药物浓度测定　本院门诊患者4例,均为女性,年龄41±12岁(26岁～55岁),体重56±4kg(50～60kg)。1例尿路感染,2例呼吸道感染,1例口腔感染。肝肾功能正常,无其他严重疾病,2周内未服用其他药物。首次晨起空腹口服司帕沙星片400mg或200mg后,在0、1、2、4、8、12、18、24h时取上肢静脉血2ml,凝后3000r^.min^-1离心5min,分离血清;并收集0～4,4～8,8～12,12～24h的尿。取血清0.5ml和尿0.5ml,按1.3项下同法操作，结果见表3。

表3　单剂量口服司帕沙星后不同时间血药浓度(mg^.L^-1)

患
者

年龄
(岁)

体重
(kg)

剂量
(mg)

血药浓度(mg^.L^-1)

1

2

4

8

12

18

24(h)

1

26

50

400

0.44

0.86

1.19

0.62

0.46

0.38

0.27

2

55

57

400

0.39

0.52

0.97

0.58

0.35

0.25

0.12

3

50

55

400

0.36

0.63

1.04

0.60

0.39

0.28

0.21

4

32

60

200

0.22

0.37

0.54

0.30

0.27

0.21

0.15

　　由表3可知，司帕沙星片单剂量口服后吸收较差,血清浓度较低,约在4h左右达到峰浓度,然后分别经过缓慢消除,24h时均保持0.1mg^.L^-1以上浓度,个体间差别不大;口服剂量减少时血清药物浓度相应下降。尿样的药物浓度测定经换算其排出率，结果发现尿中原型药物24h排出率为8%～11%,并且集中在8h以后排出。不同时间平均血药浓度结果，见表3,各时间段尿中原型药物排出率，见表4。

表4　单剂量口服司帕沙星后尿药排出率(％)

患　者

不同时间排出率

0～4

4～8

8～12

12～24

0～24(h)

1

0.94

1.85

3.47

4.81

11.07

2

1.34

1.46

3.86

4.05

10.71

3

0.85

1.73

3.04

3.34

8.94

4

0.63

1.28

2.58

4.21

8.70

3　讨　论
司帕沙星结构中同时具有芳胺和芳酸结构,整体呈现酸性,曾试图应用三乙胺（或二乙胺)与磷酸组成的缓冲对甲醇(或乙腈)水溶液作流动相,但司帕沙星保留时间太短,不能与体液中的有关杂质峰充分分离。应用磷酸二氢钾与磷酸组成缓冲对并加入离子对试剂庚烷磺酸钠后，司帕沙星保留时间增加约一倍,可有效地保证药物与杂质的分离。
出于验证本实验中建立的高效液相色谱法的目的,选择了4例应用司帕沙星的患者进行了血、尿浓度测定,为药物动力学数据的测定提供了可靠的方法，为临床药物监测提供了依据。

作者简介：梁竹，女，主管药师。

作者单位：中国人民解放军济南军区总医院　济南　250031

参考文献：
1　李眉.斯帕沙星的药理和临床应用.药学情报通讯,1994;12(2):84
2　吴永乐,张用信.新喹诺酮类药物对革兰阳性菌的作用.国外医药抗生素分册,1995;16(4):291
3　Guan Lan, Woodcock JM and Wise R. Stability study of various fluoroquinolones.中国抗生素杂志,1995;20(1):26
4　濑川 义成,新井 隆.スパルフロキサシンの物理的化学的性质および制制剂安定性.化学疗法の领域,1994;10(4):104
5　李眉.氟喹诺酮类药物分析方法进展.药物分析杂志,1998;18(6):412

(本文编辑　王绪明)

收稿日期：1999-02-23
修改日期：1999-05-13