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高效液相色谱法同时测定血液中氯硝安定、佳静安定和安定

来源:中国色谱网
摘要:天津医科大学法医教研室300070天津医科大学实验中心300070氯硝安定、佳静安定和安定为临床上较常用的镇静安眠药。本文从法医学检案需要和临床中毒病人快速诊断实际出发,建立了用HPLC法同时测定生物检材中氯硝安定、佳静安定和安定的方法。0mL/min。3试剂和药品氯硝安定、佳静安定和安定标准品(中国药品生物......

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天津医科大学法医教研室 300070

天津医科大学实验中心 300070


氯硝安定、佳静安定和安定为临床上较常用的镇静安眠药。近年来临床应用越来越广。由于市面上较易购到,故而中毒的病例较常见。有关这类药的分析方法,已有不少报道
[1~7]。本文从法医学检案需要和临床中毒病人快速诊断实际出发,建立了用HPLC法同时测定生物检材中氯硝安定、佳静安定和安定的方法。该方法操作简便、快速、准确,为法医学检案中中毒案例检材的采取和毒物分析结果的评价提供了科学依据。
1 仪器、色谱条件与试药
1.1 仪器 日本岛津LC-6A高效液相色谱仪(包括LC-6A恒流泵、CTO-6A柱恒温箱、SPD-6AV可调波长紫外检测器、SCL-6B色谱系统控制器、C-R4A色谱数据处理机)、固相萃取SPE-C18小柱。
1.2 色谱条件 色谱柱:YWG-C18 10 μm 4.6 mm×150 mm(天津三维色谱仪器配件厂);流动相:甲醇—水(65∶35);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;灵敏度:0.01 AUFS;柱温:45 ℃;进样量:20 μL。
1.3 试剂和药品 氯硝安定、佳静安定和安定标准品(中国药品生物制品检定所),氯硝安定片、佳静安定片和安定片均为市售品,内标物二苯胺为分析纯,甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。所用水为重蒸馏水。
2 溶液的制备
精密称取氯硝安定、佳静安定和安定标准品各20 mg分别置于100 mL容量瓶中,加甲醇溶解后,定容成0.2 mg/mL标准贮备液。
精密称取内标物二苯胺20 mg置于100 mL容量瓶中,加甲醇溶解后,定容成0.2 mg/mL内标贮备液。
3 方法与结果
3.1 线性关系 取6份空白血清各1.0 mL,加一系列浓度的氯硝安定、佳静安定和安定标准贮备液,使血清中氯硝安定的浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 μg/mL,佳静安定和安定的浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg/mL,再分别精密加入内标二苯胺40 μL(相当于8.0 μg),在旋涡混合器上充分混匀后,通过已活化好的SPE-C18小柱,用水2 mL冲洗小柱,弃去水溶液,除去小柱上残留的水液,再用4.0 mL甲醇冲洗2次,接收甲醇洗脱液在60 ℃下用氮气流吹干,残留物用100 μL流动相溶解后,取20μL注入色谱柱。以上述3种药物与二苯胺(内标)的比值为纵坐标,以3种药物浓度为横坐标,进行回归得回归方程为:
Y
氯硝安定=4.2382X-0.0326 r=0.998
Y
佳静安定=6.0818X-0.0465 r=0.994
Y
安定=6.2784X-0.0548 r=0.995
结果表明氯硝安定血药浓度在0.05~1.0 μg/mL,佳静安定和安定血药浓度在0.5~10 μg/mL范围内线性关系良好。最低检测限5 ng。氯硝安定、佳静安定和安定及内标物的保留时间分别为2.89、3.46、5.56和6.88 min,见图1。


图1 色谱图
1.氯硝安定 2.佳静安定
3.安定 4.二苯胺(内标)

3.2 回收率 取空白血清1.0 mL若干份,分别加入上述3种药物标准贮备液,使血清中氯硝安定的浓度为0.1、0.4、0.8 μg/mL,佳静安定和安定浓度均为1.0、4.0、8.0 μg/mL,再分别加入内标溶液40 μL混匀后,按“线性关系”项下,提取、测定,计算回收率。结果见表1。

表1 血液中三种药物方法回收率(n=3)

药物名称

加入量/
(μg/ml)

回收率/

RSD/

氯硝安定

0.1

93.58

2.1

 

0.4

97.67

1.8

 

0.8

98.53

1.2

佳静安定

1.0

96.18

2.3

 

4.0

94.15

2.6

 

8.0

96.06

1.4

安  定

1.0

94.28

1.6

 

4.0

93.16

2.4

 

8.0

93.58

2.7

3.3 精密度及重复试验 取上述空白血清1.0 mL若干份,按“线性关系”项下方法处理、进样,连续测定3次,进行重复性试验并计算日内误差;另取上述不同浓度的标准血清各3份,同法处理、进样,分别测定,计算日间误差,结果氯硝安定、佳静安定和安定日内RSD分别为2.1 %、2.3 %、1.6 %。日间RSD分别为2.0 %、2.4 %、1.9 %。3.4 方法应用 临床监测6例分别口服上述药物的急性中毒者,静脉取血,分离血清,经预处理后,按前述方法进行药物浓度测定。结果测得氯硝安定血药浓度为0.34 mg/L,佳静安定0.82 mg/L,安定7.8 mg/L。
4 讨论
利用本方法我们还测定了舒乐安定、三唑安定、阿米妥、氯丙嗪、奋乃静等,除舒乐安定与佳静安定保留时间较接近,分离度较小外,其它各药物均不干扰上述3种药物的测定。

参考文献
1  文丽荣等.RP-HPLC法同时测定血浆中阿普唑仑和多虑平.药物分析杂志,1994,14(1):3
2  王 丽等.氯硝安定血浓度测定的高效液相色谱法.中国临床药理学杂志,1994,10(3):181
3  付崇铭等.高效液相色谱法测定血液中阿普唑仑的浓度.中华医学检验杂志,1991,14(1):15
4  
Jin L,et al.Determination of alprozolam and its major metabolites in serum microsamples by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetics in rats.J Chromatogr B,1994654(1):77
5
  Hall M A,et al.High-performance liquid chromatography of alprazolam in postmortem blood using solid-phase extraction.J Anal Toxicol,1995,19(6):511
6
  Rogers W O,et al.Detection of alprazolam in three&127;cases methadone/benzodiazepine overdose.J Forens Sci,1997,42(1):155
7
  Lacroix C,et al.Monitoring of benzodiazepines(clobazam,diazepamand their main active metabolites)in human plasma by column-switching high-performance liquid chromatography.J Chromatogr1993,617(2):285

(本文于1997年12月30日收到)

 

作者: 洪燕敏井连平 董伟林张竟超 2007-5-18
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