反相高效液相色谱法同时测定利福烟胺片中利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的含量

(北京市药品检验所　100035)

摘要　　应用反相高效液相色谱法，采用Spherisorb CN柱，0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(pH 2.0)—乙腈(44∶56)为流动相，盐酸萘唑啉为内标，254 nm检测，建立了同时测定利福烟胺片中利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的含量测定方法，并可同时分离出主要杂质醌式利福平、3-甲酰利福霉素—异烟肼复合物，结果令人满意。
关键词：反相高效液相色谱法　利福平　异烟肼　吡嗪酰胺
利福平、异烟肼和吡嗪酰胺可分别作用于3种不同菌群，因而三药的联合制剂是很有效的抗结核药物，目前国内尚未见生产及检验方面的报道，进口药品有美国的卫非特片和印度的利福烟胺片。有文献报道用HPLC法同时测定利福平和异烟肼^［1］或利福平和吡嗪酰胺^［2］的含量。由于异烟肼的极性和吡嗪酰胺较为接近，与利福平相差较大，因而选用非极性C₈、C₁₈柱分析时，可使三组分同时得到有效分离的流动相寻找较为困难。本文介绍的HPLC方法，可将三组分同时测定，省时省力省试剂，又可使2个主要杂质与主峰分离完全，分析时间适中，采用的内标法准确、精密，重现性好，所用试剂均国内有售。经回收实验证明，方法可行。1　仪器、试剂和试样
BIO—RAD液相色谱仪(Bio-Rad UV 1806检测器，岛津C—R6A数据处理仪)。
乙腈(色谱纯)，北京化工厂生产。
庚烷磺酸钠(分析纯)，中国药品生物制品检定所提供。
利福平、异烟肼和吡嗪酰胺对照品(纯度分别为98.39 %、99.68 %、99.52 %)及利福烟胺片(每片含利福平225 mg、异烟肼150 mg、吡嗪酰胺750 mg)均由印度Lupin药厂提供。
醌式利福平及复合物杂质对照品由Merck公司提供。
内标物盐酸萘唑啉(分析纯)，由日本化工株式会社提供。
2　色谱条件
色谱柱：Spherisorb CN(10 μm)，250mm×4.6mm，由中国科学院大连化学物理研究所生产；流动相：0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(稀磷酸调至pH 2.0)—乙腈(44∶56)；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。
3　流动相、内标物质及溶剂选择
3.1　流动相　各组分的色谱行为对流动相中的乙腈比例和pH最为敏感。当乙腈比例低于45 %(V/V)时，利福平的保留时间过长且峰形不好；高于58 %(V/V)时，杂质与主成分不能得到有效分离甚至重合；如用甲醇代替乙腈，各组分保留时间均大大延长，且拖尾严重。
随着流动相的pH和缓冲液浓度的增加，异烟肼和吡嗪酰胺出峰提前，二者与复合物将不能完全分离甚至重合。但当缓冲液浓度减少至0.005 mol/L时，则利福平又出峰较慢，峰形不好。经实验比较，选择0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(pH 2.0)—乙腈(44∶56)作流动相，各组分分离效果较佳，保留时间及测定时间适中。
3.2　内标物　在选定的色谱条件下筛选内标物，曾实验乙酰苯胺、对氨基苯甲酸、对二甲氨基苯甲醛、水杨酸、氧氟沙星、诺氟沙星、盐酸萘唑啉，结果盐酸萘唑啉(t_R≈11 min)效果最好，各组分与内标物的分离图谱见图1。
3.3　溶剂　分别采用甲醇、乙腈及流动相为溶剂考察样品溶液的稳定性及色谱峰形的变化。结果表明：用甲醇或乙腈制备样品溶液均能保持较长时间的稳定，但二者均有溶剂峰且与吡嗪酰胺峰接近；用流动相制备样品溶液，利福平峰在0.5 h后略有下降，复合物杂质逐渐增加，并有其它未知杂质出现。故最终确定制备样品溶液时，第一步溶剂采用甲醇，第二步采用流动相，终溶液需立即进样^［3］。

图1　样品色谱图

1.吡嗪酰胺(3.09 min)　2.未知杂质(4.04 min)
3.异烟肼(5.22 min)　4.复合物(6.33 min)
5.盐酸萘唑啉(10.62 min)　6.醌式利福平(11.69 min)
7.利福平(13.19 min)

4　线性关系测定
4.1　准确称取盐酸萘唑啉约2.5 g，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，摇匀即得内标溶液。
4.2　按在制剂中的比例，取利福平对照品约45 mg、异烟肼约30 mg、吡嗪酰胺约150 mg，分别精密称定，置同一100 mL量瓶中，加甲醇振摇溶解并至刻度，摇匀即得对照品溶液。
4.3　　精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置50 mL量瓶中，各加内标溶液2 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，取10 μL进样，记录各组分峰面积，以各组分进样量(μg)为纵坐标，相应峰面积和内标峰面积之比为横坐标作图，计算回归方程，结果见表1。

表1　线性关系测定结果

组分

回归方程　　　

r

进样量范围/
μg

吡嗪酰胺

Y＝0.079X-0.0065

0.9999

0.312～1.248

异烟肼　

Y＝0.079X+0.0002

0.9999

0.084～0.336

利福平　

Y＝0.072X+0.0137

0.9997

0.089～0.352

5　回收实验测定
取样品10片，研细混匀，精密称取细粉适量(约相当于1/10片量)置50 mL量瓶中，精密加上述对照品溶液10 mL，加甲醇振摇溶解并至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液2.0 mL置50 mL量瓶中，加内标溶液2 mL，并用流动相稀释至刻度，摇匀。同法制备5份。分别取10 μL进样测定并按内标法计算，吡嗪酰胺、异烟肼、利福平?的?平?均?回?收?率(n=5)分别为100.1 %、99.53 %、99.77 %，RSD分别为1.06 %、2.07 %、1.56 %。
6　样品测定
取利福烟胺片样品3批各20片，分别研细，并分别精密称取细粉适量(约相当于1片量)5份，各置100 mL量瓶中，加甲醇振摇溶解并至刻度，滤过。精密量取续滤液10 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取该溶液2 mL置50 mL量瓶中，加内标溶液2 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，取10 μL立即进样。另按制剂中三组分的比例，取利福平、异烟肼、吡嗪酰胺对照品各适量置同一50 mL量瓶中，同法测定，按内标法计算样品中三组分的含量，结果见表2。

表2　样品含量测定结果(标示量%，n=5)

批号

吡嗪酰胺

异烟肼

利福平

6009

97.74(1.11)

97.78(1.85)

95.55(1.20)

248

96.41(0.88)

95.67(2.50)

103.1(1.04)

6012

100.1(0.98)

96.60(2.20)

97.61(2.15)

注：括号内为RSD(%)值
7　讨论
7.1　由于样品为多组分同时测定，故采用内标法，结果的重现性较好。
7.2　本法不能用于该制剂的溶出度测定，因为利福平在水性溶出介质中不稳定，在规定的溶出时间内，利福平约有50 %转变为醌式利福平。

。

参考文献
1　　Zeinab H,et al.Analytical separation of isoniazid and rifampicin in mixtures by reversed phase high performance liquid chromatography.Egypt J Pharm Sci,1988,29(1～4)：521
2　　Jean W,et al.Liquid chromatographic assay for the simultaneous determination of pyrazinamide and rifampicin in serum samples from patients with tuberculous meningitis.J Chromatogr,1987,420:73
3　　周景云等.pH及缓冲液对利福平水溶液稳定性的影响.中国药学杂志，1996，31(7)：406

(本文于1997年6月23日收到)

Analytical Separation of Rifampicin,Isoniazid and Pyrazinamide

in Compound Rifampicin Tablets by RP-HPLC

Pang Qingyun,Lu Yan,Yu Li,Dai Hong and Tian Hongzhao
(Beijing Institute for Drug Control,100035)

　　Abstract:This paper reports a simultaneous determination method of three components in compound rifampicin tablets,using RP-HPLC with a Spherisorb-CN column(10 μm,4.6mm×250mm)and a mobile phase of 0.01 mol/L sodium 1-heptane sulfonate(pH 2.0)—acetonitrile(44∶56).Naphazolin hydrochloride was selected as the internal standard.The detection wavelength was 254 nm.All the results for the standard curve,the recovery and the separation showed that the method is satisfactory.
　　Key words:rifampicin,isoniazid,pyrazinamide,RP-HPLC