HPLC测定吴茱萸及其制剂中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量

摘要　目的：建立吴茱萸药材及其制剂华佗再造丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量测定方法。方法：反相高效液相色谱法。主要色谱条件包括：吴茱萸药材：流动相为乙腈-水(50∶50)，流速1.0ml^.min^-1，内标物为醋酸甲羟孕酮；华佗再造丸：流动相为乙腈-水(40∶60)，流速1.0ml^.min^-1，内标物为联苯；紫外检测波长均为225nm。结果：吴茱萸药材中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的线性浓度范围均为5～50μg^.ml^-1；回收率分别为96.6%和96.4%；批内RSD分别为0.8%～1.5%和1.1%～2.3%(n=6)；批间RSD分别为2.3%～3.6%和2.5%～3.9%(n=6)。华佗再造丸中二组分的线性浓度范围均为0.5～20μg^.ml^-1；回收率分别为97.6%和94.6%。经测定，同种不同产地的4种吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量分别为0.118%和0.092%，0.213%和0.106%，0.581%和0.609%，0.478%和0.459%；华佗再造丸中二组分的含量分别为0.1123mg^.g^-1和0.0981mg^.g^-1。结论：该方法可用于吴茱萸药材及其制剂的质量控制。
关键词　HPLC；吴茱萸；华佗再造丸；吴茱萸碱；吴茱萸次碱

Determination of evodiamine and rutaecarpine in Evodia rutaecarpa and Huatuo Zaizao Pill by HPLC

Yu Zhiguo (Yu ZG),Hou Xiaohong (Hou XH),Shi Yamin (Shi YM) et al
Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang110015

ABSTRACT　OBJECTIVE:To establish a quantitative method for the determination of two main active ingredients,evodiamine and rutaecarpine,in Chinese medicinal crop Evodia rutaecarpa and its preparation Huatuo Zaizao pill.METHOD:Evodiamine and rutaecarpine were determined by RP-HPLC for Evodia rutaecarpa,the mobile phase consisted of acetonitrile-water (50∶50),the flow rate was 1.0ml^.min^-1，medroxyprogesteron acetate was used as internal standard.For Huatuo Zaizao pill,the mobile phase consisted of acetonitrile-water (40∶60),the flow rate was 1.0ml^.min^-1,biphenyl was used as internal standard.The eluent was monitored with UV detector at 225nm.RESULTS:For Evodia rutaecarpa,the standard curves of evodiamine and rutaecarpine were all linear over the concentration range of 5～50μg^.min^-1.The average recoveries were 96.6% and 96.4% respectively.The intra-run relative standard deviations were 0.8%～1.5% and 1.1%～2.3%(n=6),respectively,the inter-run relative standard deviations were 2.3%～3.6% and 2.5%～3.9% (n=6),respectively.For Huatuo Zaizao pill,the standard curve of evodiamine and rutaecarpine were all linear over the range of 5～20μg*ml^-1,the average recoveries were 97.6% and 94.6%,respectively.The contents of evodiamine and rutaecarpine in Evodia rutaecarpa from four localities of growth were 0.118% and 0.092%,0.213% and 0.106%,0.581% and 0.609%,0.478% and 0.459%,respectively.In Huatuo Zaizao pill,the contents of two ingredients were 0.1123mg^.g^-1 and 0.0981 mg^.g^-1,respectively.CONCLUSION:This method is accurate,convenient and sensitive.It is satisfactory for the quality control of Evodia rutaecarpa and its preparations.
KEY　WORDS　HPLC,Evodia rutaecarpa,Huatuo Zaizao pill,evodiamine,rutaecarpine

　　吴茱萸［Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth］为芸香科植物吴茱萸的干燥未成熟果实，具有温胃止呕、温脾止泻、镇痛、保持体温等功效，其主要成分为挥发油和生物碱两类，而吴茱萸碱(evodiamine,Ⅰ)和吴茱萸次碱(rutaecarpine,Ⅱ)又为其主要生物碱。华佗再造丸为中国药典收载品种，是治疗和预防心、脑血管疾病及其后遗症中风瘫痪的中药制剂，其主要成分有川芎、吴茱萸、冰片等。本实验以Ⅰ和Ⅱ为测定指标，采用反相高效液相色谱法，对吴茱萸药材和华佗再造丸的质量加以控制。该方法具有准确、重视性好、选择性强等优点，可用于吴茱萸及其制剂的质量控制研究。

1　仪器与试药

　　岛津LC-10AD液相色谱，SPD-10A紫外-可见检测器，C-R6A色谱数据处理器；色谱柱：Spherisorb C₁₈柱(250mm×4.6mm,10μm，大连依利特科学仪器有限公司)；对照品Ⅰ和Ⅱ(中国药品生物制品检定所)，生品吴茱萸分别产于贵州铜仁、贵州江口、广西田林、广西百色(经生药学鉴定均属芸香科植物)；华佗再造丸(市售品，广州奇星药业有限公司，9512466B15)；醋酸甲羟孕酮(符合中国药典规定)；联苯(化学试剂，分析醇)，乙腈(色谱纯)，甲醇(分析纯)。

2　吴茱萸药材测定方法

2.1　色谱条件　流动相：乙腈-水(50∶50)；流速：1.0ml^.min^-1；检测波长：225nm；柱温：室温。在此条件下，对照品Ⅰ，Ⅱ及内标均完全分离，且峰形稳定，见图1。
2.2　标准曲线的绘制　精密称取Ⅰ和Ⅱ对照品各适量，分别以甲醇溶解制成0.5mg^.ml^-1的标准溶液。另精密称取醋酸甲羟孕酮适量，以甲醇溶解制成0.5mg^.ml^-1的内标溶液。分别精密吸取Ⅰ标准溶液和Ⅱ标准溶液各0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于同一10ml量瓶中，各精密加入内标溶液1ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀。依次各进样20μl。按峰高比Y对进样浓度c(μg^.ml^-1)回归，求得回归方程：
Ⅰ：Y＝0.03314+0.03184c(r=0.9998,n=6)Ⅱ：Y=0.01582+0.03228c(r=0.9996,n=6)线性范围均为5～50μg^.ml^-1。

图1　贵州铜仁产吴茱萸的色谱图
9.408min—吴茱萸碱；12.858min—吴茱萸次碱；20.275min—醋酸甲羟孕酮

2.3　回收率试验　以贵州铜仁吴茱萸为样品，精密称取适量，置索氏提取器中，分别精密加入Ⅰ和Ⅱ标准溶液各5ml，以150ml甲醇加热回流提取至提取液无碘化铋钾反应。将提取液浓缩并定量转移至25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置过夜。精密吸取上清液1ml，置10ml量瓶中，精密加入内标溶液1ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜(0.45μm)，取滤液依次进样20μl，计算回收率。测得Ⅰ和Ⅱ的平均回收率分别为96.6%和96.4%，RSD分别为2.4%和2.9%，见表1。

　　　　　　表1　吴茱萸药材中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的回收率测定结果

　　　　表2　4种不同产地吴茱萸样品的测定结果.n=6

3.1　色谱条件　流动相：乙腈-水(40∶60)；流速：1.0ml^.min^-1；检测波长：225nm；柱温：室温。经二极管阵列检测，保留时间为26.465min和34.45min峰的紫外吸收曲线分别与Ⅰ和Ⅱ对照品的完全相同，可以认定分别为Ⅰ和Ⅱ的色谱峰。在此条件下Ⅰ和Ⅱ及内标物均完全分离，且基线平稳、峰形稳定，见图2。

图2　华佗再造丸的色谱图
26.465min—吴茱萸碱；34.45min—吴茱萸次碱；59.538min—内标

3.2　标准曲线的绘制　精密称取Ⅰ和Ⅱ对照品各适量，分别以甲醇溶解制成0.5mg^.ml^-1的标准溶液。另精密称取联苯适量，以甲醇溶解制成2.0mg^.ml^-1的内标溶液。分别精密吸取Ⅰ和Ⅱ标准溶液各10，20，50，100，200，400μl于同一10ml量瓶中，分别精密加入内标溶液1ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀。依次各进样20μl。按峰高比Y对浓度c(μg^.ml^-1)回归，求得回归方程：
Ⅰ：Y=0.0143+0.0216c(r=0.9995,n=6)
Ⅱ：Y=0.0054+0.0093c(r=0.9999,n=6)
线性范围为0.5～20μg^.ml^-1。
3.3　回收率试验　取华佗再造丸，粉碎成细粉，精密称取适量，置索氏提取器中，分别精密加入Ⅰ和Ⅱ标准溶液各1ml，其余按吴茱萸药材“2.3”项下方法操作。精密吸取上清液2ml，同法测定，平均回收率分别为97.6%和94.6%，RSD分别为21%和1.8%，见表3。

　　　　　表3　华佗再造丸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的回收率测定结果

　　　　　表4　华佗再造丸样品的测定结果

4.1　对华佗再造丸细粉进行了甲醇索氏提取、氯仿索氏提取、经硅藻土研磨后甲醇提取、甲醇提取后脱脂、15%甲醇乙醇提取^［1］等提取方法的考察，HPLC结果显示甲醇索氏提取方法，Ⅰ，Ⅱ及干扰成分均完全分离，基线平稳。
4.2　通过测定4种同种不同产地的吴茱萸中Ⅰ和Ⅱ的含量，发现其含量有较大差别，以广西田林的含量为最高，贵州铜仁的为最低，二者含量相差达5～6倍。文献报道^［2］上述两种生物碱可能为其有效成分。因此，控制吴茱萸中两种生物碱的含量可保证药材的质量和成药的疗效。
4.3　在吴茱萸药材的色谱条件下Ⅰ和Ⅱ的分离度为1.4，Ⅰ，Ⅱ与干扰成分的分离度也均大于1.0。Ⅰ和Ⅱ的理论板数分别为3600和2300；在华佗再造丸的色谱条件下Ⅰ和Ⅱ及干扰成分均获得良好分离。

作者单位：于治国　侯晓虹　时雅旻　毕开顺　沈阳110015沈阳药科大学；
马俊凤青岛266042青岛市肿瘤医院

参考文献

1　朱柏华，彭中芳，刘声波.HPLC测定华佗再造丸中阿魏酸的含量.中国中药杂志，1997，22(3)：164.
2　江苏新医学院.中药大词典.上海：上海人民出版社，1977：1118.

收稿：1999-04-14