反相高效液相色谱法测定来氟米特*

摘要　目的：建立反相高效液相色谱测定来氟米特的方法。方法：采用Hypersil ODS C₁₈柱，流动相为甲醇-水-磷酸，检测波长为260nm,流速为1.0ml^.min^-1，进样量为20μl，以萘或联苯酚为内标。

结果：两峰分离完全，以萘为内标：来氟米特线性范围0.0955～7.6400μg^.ml^-1(r=0.9999)，检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n=5)和0.86%(n=5)，平均回收率为99.66%(RSD＝0.80%)；以联苯酚为内标：来氟米特线性范围0.141～8.460μg^.ml^-1(r=0.9997)，检测限为0.8ng，日内偏差 和日间偏差分别为0.86%(n＝5)和1.06%(n=5)，平均回收率为100.48%(RSD＝1.60%)。

结论：方法简便，结果准确。

Determination of leflunomide by RP-HPLC

Zhu Quangang (Zhu QG),Hu Jinhong(Hu JH),Sun Huajun (Sun HJ)
(Department of Pharmacy,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433)

ABSTRACT　OBJECTIVE:To establish a method for determination of leflunomide using reversed-phase high performance liquid chromatography.METHODS:Chromatographic conditions included Hypersil ODS C₁₈ column and the mobile phase consisting of a mixture of methanol-water-phosphoric acid.Detection wavelength was at 260 nm.The flow rate was 1.0 ml^.min^-1.Naphthalene or p-phenylphenol was selected as the internal standard.RESULTS:When naphthalene was used as the internal standard,the linearity between concentration and peak area ratio was obtained from 0.0955μg^.ml^-1 to 7.6400μg^.ml^-1 (r=0.9999),the detection limit was 0.8ng,within-day and between-day variation coefficients were 0.76% (n=5) and 0.86%(n=5)，the average recovery was 99.66% (RSD=0.80%).When p-phenylphenol was used as the internal standard,the linearity between concentration and peak area ratio was obtained from 0.141μg^.ml^-1 to 8.460μg^.ml^-1(r=0.9997),the detection limit was 0.8ng,within-day and between-day variation coefficients were 0.86% (n=5) and 1.06%(n=5),the average recovery was 100.48% (RSD=1.60%).CONCLUSION:The method was found to be simple and accurate.
KEY　WORDS　leflunomide,RP-HPLC

　　来氟米特(leflunomide,简称LFM)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异唑类衍生物，其作用机制不同于已知的抗炎及免疫抑制药物，对多种自身免疫性疾病有治疗作用，Ⅲ期临床试验显示治疗类风湿性关节炎效果显著，1998年由德国Hoechs Marion Roussel公司首次在美国上市^［1］，但其含量测定的方法未见详细报道。本实验采用的反相高效液相色谱方法，分别以萘或联苯酚为内标，定量分析来氟米特，快速准确，灵敏度高。

1　仪器和试药

　　高效液相色谱仪，包括Waters Maxima 820工作站，Waters 510泵，Waters 486可变波长紫外检测器，U6K进样器(美国Waters公司)；UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。
LFM(本院药物合成室提供)；联苯酚(Sigma公司)；萘(色谱纯，上海试剂一厂)；甲醇(色谱纯，上海化学试剂研究所)。其它试剂均为分析纯。

2　实验方法

2.1　色谱条件
色谱柱为Hypersil ODS C₁₈柱(4.6mm×150mm,10μm,大连依利特科学仪器有限公司)，检测波长为260nm，流速为1.0ml^.min^-1，灵敏度0.01 AUFS，进样量20μl，室温操作。以萘为内标，流动相为甲醇-水-磷酸(67∶33∶0.006)；以联苯酚为内标，流动相为甲醇-水-磷酸(65∶35∶0.06)。
2.2　储备液、工作液、标准液制备
2.2.1　萘作为内标　精密称取干燥恒重萘适量，加流动相稀释成1.64mg^.ml^-1的储备液，再精密量取该储备液1ml，加流动相稀释成16.4μg^.ml^-1的工作液；精密称取干燥恒重LFM适量，加流动相稀释成3.82mg^.ml^-1的储备液，再精密量取该储备液1ml，加流动相稀释成38.2μg^.ml^-1的工作液。精密量取LFM工作液0.025，0.050，0.100，0.250，0.500，1.000，2.000ml至10ml量瓶中，加入萘工作液1.000ml，用流动相稀释成0.0955，0.191，0.382，0.955，1.910，3.820，7.640μg^.ml^-1的系列标准液。
2.2.2　联苯酚作为内标　精密称取干燥恒重联苯酚适量，加流动相稀释成1.213mg^.ml^-1的储备液，再精密量取该储备液0.75ml，加流动相稀释成18.195μg^.ml^-1的工作液；精密称取干燥恒重LFM适量，加流动相稀释成0.564mg^.ml^-1的储备液，再精密量取该储备液1ml，加流动相稀释成56.4μg^.ml^-1的工作溶液。精密量取LFM工作液0.025，0.050，0.100，0.500，1.000，1.500ml至10ml量瓶中，加入联苯酚工作液0.200ml，用流动相稀释成0.141，0.282，0.564，2.820，5.640，8.460μg^.ml^-1的系列标准液。

3　结　果

3.1　萘作为内标
以LFM的浓度c对LFM与内标的峰面积比R进行回归，在浓度范围0.0955～7.6400μg^.ml^-1内线性良好 ，得回归方程c＝-0.0020+0.6989R，r=0.9999(n=7)，方法检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n=5)和0.86%(n=5)，方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。内标萘的保留时间约9.11min，LFM的保留时间约 5.92min，两峰分离良好。见图1。

图1　来氟米特和萘的HPLC图
A-来氟米特；B-萘

3.2　联苯酚作为内标
以LFM的浓度c对LFM与内标的峰面积比R进行回归，在浓度范围0.141～8.46μg^.ml^-1内线性良好，得回归方程c＝-0.0458+0.5647R，r=0.9997(n=5)，方法检测限为0.8ng，日内偏差和日间偏差分别为0.86%(n=5)和1.06%(n=5)，方法回收率为100.48%(RSD=1.60%)。内标联苯酚的保留时间约6.28min，LFM的保留时间约7.53min，两峰分离良好。见图2。

图2　来氟米特和联苯酚的HPLC图
A-来氟米特；B-联苯酚

(收稿：1998-12-10)