高效液相色谱法同时测定抗癫痫和苯二氮两类常用药物的血清浓度

摘要　目的：建立抗癫痫和苯二氮两类药物血清浓度测定方法。方法：血清0.4ml，加叔丁基甲醚4ml提取，40℃以下N₂吹干，残渣用甲醇溶解，进样分析，色谱条件为Shim-Pack，CLC-C₈柱(150mm×6mm,10μm)，流动相为甲醇-乙腈-水(40∶13∶47)，检测波长254nm，温度40℃。结果：8种药物一次性分离，血清杂质不干扰测定，线性方程相关系数大于0.999，方法回收率91％～106％。日内、日间精密度(RSD)均小于9%。结论：方法简便快速。适用于临床血药浓度监测及此两类中毒药物的快速定性定量分析。

Simultaneous determination of antiepileptic drugs and benzodiazepines in serum by HPLC

Zhong Xiaobin (Zhong XB),Yang Zhenghong (Yang ZH),Wu Chuang (Wu C),et al
The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530027

ABSTRACT　OBJECTIVE:To establish a rapid and simple HPLC method for the determination of antiepileptic drugs and benzodiazepines in serum simultaneously.METHOD:The serum samples were extracted by MTBE after addition of asarone as the internal standard.The residue was reconstituted in methanol and detected at 254nm.The mabile phase consisted of methanol-acetonitrile-water (40∶13∶47).The Shim-pack CLC-C₈(150mm×6mm,10μm) column was used.RESULTS:8 drugs and internal standard were separated well automatically.The coefficients of the linear equation was larger than 0.999.The rate of recovery was from 91% to 106%,and the variation coefficients of the between-day and within-day assay were less than 9%.CONCLUSION:The method was simple and rapid.It was suitable for rapid qualitative and quantitative determination of seueral toxic drugs in the serum simultaneously.
KEY　WORDS　antiepileptic drugs,benzodiazepines,HPLC,serum concentration

　　抗癫痫药由于个体差异大，且治疗窗窄，易于中毒，列为临床监测的常规药物，苯二氮类药物在中毒药物中位居首位^［1］，亦为临床常测定药物。国内外对此两类药物测定多采用HPLC，但由于HPLC需对血样进行较复杂的预处理及变换测定品种需更换色谱条件，使得每个样品都采用不同的提取法及色谱条件，浪费大量的时间及试剂，而且急性中毒患者无法进行快速定性定量分析，目前国内外的研究趋向于同一条件测定多个药物^［2～8］，以解决临床日益增多的测定样品。HPLC同时测定抗癫痫药或同时测定某些苯二氮类药物虽有报道，但均未能将此两类药物一次性分离。为此，本实验建立了同时测定抗癫痫和苯二氮两类药物的HPLC，并应用于药物治疗浓度监测及中毒抢救。

1　仪器及药品

　　日本岛津系列LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6AV检测器，SCL-6B系统控制器，C-R4A色谱数据处理仪，电子天平(德国沙多利斯-2001)。苯巴比妥、卡马西平、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、地西泮对照品(中国药品生物制品检定所)，苯妥英(卫生部临床检验中心)，α-细辛脑(广西柳州市制药厂)，氯氮(本实验室精制，经中国药典法测定)，甲醇为优级纯，乙腈为色谱纯，95%乙醇、叔丁基甲醚为分析纯。

2　实验方法

2.1　标准溶液制备
精密称取对照品适量，置10ml量瓶中，乙醇超声波振荡溶解后定容，各吸取适量置10ml量瓶，配成混合标准液：苯巴比妥、苯妥英均为0.4mg^.ml^-1，卡马西平为0.16mg^.ml^-1，硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、地西泮均为40μg^.ml^-1，临用前稀释，内标α-细辛脑用乙醇配成浓度为50mg^.ml^-1。
2.2　色谱条件
Shim-Pack CLC-C₈ 柱(150mm×6mm)，流动相：甲醇-乙腈-水(40∶13∶47)，检测波长254nm，灵敏度0.005，温度40℃。
2.3　样品处理
取血清0.4ml，加入内标液8μl，混匀，加叔丁基甲醚4ml，在旋涡混合器上振荡提取2min，离心5min(3000r^.min^-1)，吸取上层有机相于另一尖底 离心管中，在40℃水浴中通氮气吹干，残留物加100μl甲醇溶解，取20μl进样。
2.4　测定方法
用内标法，单点内标校正法求算血药浓度。

3　结　果

3.1　分离效果
空白血清及空白血清加样提取色谱图见图1。苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、氯氮、α-细辛脑、地西泮保留时间分别为6.4，9.6，10.5，11.8，13.4，15.4，16.8，19.7，22.1min，分离效果良好，血清杂质不干扰测定。

图1　空白血清(A)和空白血清加样(B)提取色谱图
1-苯巴比妥；2-苯妥英；3-卡马西平；4-硝西泮；5-艾司唑仑；6-阿普唑仑；7-氯氮；8-α-细辛脑；9-地西泮

3.2　血清提取标准曲线
取血清0.4ml，精密加入标准混合液适量，各加等量内标液8μl，混匀，依法测定，平行操作两次，取两次峰面积比值(Y)的平均值对相应浓度(X)进行线性回归，结果见表1。

　　　　　　表1　标准曲线测定结果

　　　　　表2　日内回收率及精密度.n＝5

表3　日间回收率及精密度.n＝5

4　讨　论

4.1　在抗癫痫药物或苯二氮类的某些药物的测定中，文献较多采用缓冲溶液^{［3，5～6］}C₁₈柱作为分析柱^{［2，4～7］}，乙醚、乙酸乙酯或己烷+乙酸乙酯作为血清药物提取溶剂^{［2，5，7～8］}，虽然也可达到很好的分离效果，但缓冲溶液损害色谱柱和泵。本实验采用甲醇-水-乙醇为流动相，C₈亦能达到很好的分离效果，而且可分离此二类药物。选用叔丁基甲醚为提取溶媒，提取效果很好，血清杂质不干扰测定。
4.2　本法用于临床中毒药物的快速筛选并定量，指导临床抢救，大大提高抢救患者的成功率。在目前大多数中毒药物尚未有特异性解救药的情况下，可用于各种药物的抢救方法研究。血液透析常用于危重中毒患者抢救，苯巴比妥每次透析后血清浓度下降一半，效果较好，但艾司唑仑合并阿普唑仑中毒患者，经3次透析，历时3d，血清浓度才下降一半。
4.3　标准混合液置4℃冰箱内保存2个月未见浓度改变，测定地西泮样品时反复出现一代谢物峰。此两类药物代谢物由于没有标准品而未能进一步研究，但尚未发现代谢峰干扰测定。

作者单位：钟小斌　杨正鸿　吴　闯　李其斌　南宁530027广西医科大学第一附属医院；
潘代勇　潘　文桂林医学院药学系98届实习生

参考文献

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2　阎小华，李焕德，张松操，等.体液中多种药物与毒物的快速测定与临床应用研究Ⅳ.RP-HPLC法同时测定血清中三种抗癫痫药物.药物分析杂志，1996，16(1)：3.
3　Lambert WE,Meyer E,Xue PY, et al.Screening,identification and quantitation of benzodiazepines in postmortem samples by HPLC with photodiode array detection.J Anal-Tonicol,1995,19(1):35.
4　冯翠玲，刘荫棠,罗毅.血样中13种安眠药镇静药的HPLC系统分析方法.药学学报，1995，30(12)：914.
5　余勤，梁茂植，邹远高，等.反相高效液相色谱法动态监测卡马西平、苯妥英、苯巴比妥血药浓度及其临床意义.华西医学，1994，9(4)：408.
6　Jin L,Lau CE.Determination of alprzaolam and its major metabolites in serum microsamples by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetics in rats.J Chromatogr B Biomed Appl,1994,654(1):77.
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8　Puopolo PR,Pothier WE,Volpicelli SA,et al.Single procedure for detection,confirmation,and quantification of benzodiazepines in serum by liquid chromatography with photodiode-array detection.Clin Chem,1991,37(5):701.

收稿：1999-02-08