用两种高效液相色谱法测定连翘中连翘苷的含量1 色谱论文 | 39康复网

摘　要　采用两种高效液相色谱法测定连翘中连翘苷的含量.方法1采用键合氨基柱，氯仿-甲醇(体积比8∶1)为流动相，平均回收率为97.4%，RSD1.06%.方法2采用ODS-C₁₈柱，以乙腈-水(体积比25∶75)为流动相，平均回收率为101.0%，RSD1.68%.
关键词　连翘；连翘苷；高效液相色谱法
分类号　R914.1

Determination of Phillyrin in Forsythia suspensa by Two Methods of HPLC

Wang Weifang,Xu Suixu,Zhang Guogang
Department of Traditional Chinese Medicines,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015

　　Abstract　This report was focused on the determination of phillyrin in the fruits of Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl by two methods of HPLC.One was carried out in the Spherisorb NH₂ column with the mobile phase of a mixture of CHCl₃-MeOH(8∶1).The average recovery was 97.4%.The other was carried out in the ODS-C₁₈ column with the mobile phase of a mixture of CH₃CN-H₂O(25∶75).The average recovery was 101.0%.
Key words　Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl;phillyrin;HPLC

　　连翘为木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果实，具有清热解毒，消肿散结的功效，为1995年版《中国药典》收载的常用中药材之一，但没有收载有关成分的含量测定法^〔1〕.国内外文献中，早期以齐墩果酸和芦丁为指标成分，采用双波长扫描紫外分光光度法进行含量测定^〔2，3〕.梁文藻等人以连翘酯苷为指标成分，采用同样方法进行含量测定^〔4〕.前者专属性较差，后者误差较大.作者选择连翘苷作为指标成分，分别采用两种高效液相色谱法，对11批连翘药材进行了含量测定，为控制连翘的质量提供了科学的依据.

1　正相高效液相色谱法
1.1　仪器与试药

　　高效液相色谱仪：美国Perkin Elmer公司1022-LC色谱工作站、LC 295 UV-VIS检测器；溶剂过滤器(大连化物所)；超声振荡仪(江苏昆山淀山湖检测仪器厂)；样品过滤器(大连化物所)；微量进样器(美国 HAMILTON 公司)；试剂：氯仿、甲醇(分析纯，沈阳化学试剂厂)、甲醇(色谱纯，中国医学科学院天津协和公司)；连翘苷(自制)；连翘药材：见表3.

1.2　色谱条件
1.2.1　紫外检测波长的选择　
见图1.从紫外图谱中可以看出，连翘苷在277 nm处有最大吸收，因此选择277 nm作为检测波长.

Fig.1　UV sepctrum of phillyrin

1.2.2　测试条件
色谱柱：Spherisorb NH₂柱(大连化物所，4.6 mm×25 cm，10 μm)；流动相：氯仿∶甲醇(8∶1)；检测波长：277　nm；柱温：27℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；灵敏度：0.02 AUFS；纸速：3 mm/min.
1.3　方法与结果
1.3.1　工作曲线的考察

　　精密称取连翘苷对照品2.006 mg，置于10 mL容量瓶中，用氯仿-甲醇(体积比6∶4)溶液溶解，稀释至刻度，作为对照品储备液.分别精密吸取该溶液0.25、0.5、1.5、2.5、3.5 mL于5 mL容量瓶中，以氯仿-甲醇(6∶4)溶液稀释至刻度，摇匀即得.分别吸取该对照品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定.经计算得色谱峰面积(A)与进样量(C)之间的回归方程为：A=504 924C+31 528.8，r=0.999 1.见图2.线性回归曲线说明：在0.2～4.0 μg范围内连翘苷的量与色谱峰面积呈良好的线性关系，且由于其不过原点，因此，采用外标两点法测定样品中连翘苷的含量.结果见表1.

Fig.2　Linear plot of absorption against amount of phillyrin

Tab.1　Linear relationship of absorption against amount

C/μg	A			Mean	RSD%
C/μg	1	2	3	Mean	RSD%
0.2	146528	144799	146228	145852	0.63
0.4	230602	233531	236456	233530	1.25
1.2	608438	623888	6155392	615906	1.26
2.0	1029658	1028249	1077196	1045034	2.67
2.8	1456944	1470912	1501126	1476327	1.53
4.0	2053814	20551943	2028728	2044828	2.63

1.3.2　供试品溶液的制备
精密称取过60目筛的本品粉末0.2 g，置于索氏提取器中，加氯仿-甲醇(体积比 6∶4)溶液 50 mL，于85℃下回流提取4 h，回收溶剂至干，残留物用氯仿-甲醇溶液溶解，转移至5 mL容量瓶中，定容，摇匀，作为供试品溶液.
1.3.3　回收率实验
采用加样回收法.精密称取连翘药粉末0.2 g共10份，分为两组，一组按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的含量，另一组加入一定量的连翘苷对照品，再同法操作，计算回收率，结果见表2.

Tab.2　Test of recovery

No.	Added /μg	Measured /μg	Recovery /%	Mean/%	RSD/%
1	0.094 7	0.170 3	97.0
2	0.094 7	0.170 7	99.0
3	0.094 7	0.168 9	96.4	97.4±1.03	1.06
4	0.094 7	0.170 1	96.8
5	0.094 7	0.170 5	97.8

1.3.4　精密度实验

　　吸取对照品溶液(0.200 6 mg/mL)，连续进样5次，每次20 μL，测定峰面积分别为1 980 872、2 053 814、2 051 943、2 028 728、2 129 780，RSD为2.63%，表明仪器具有良好的精密度.
1.3.5　重现性实验
精密称取03号样品0.2 g 5份，按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的峰面积，结果分别为188 647、188 997、191 284、190 345、182 457，RSD为2.36%.
1.3.6　标准品纯度检测
吸取连翘苷溶液(浓度为2.356 mg/mL的甲醇溶液)15 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得连翘苷对照品纯度为100%.
1.3.7　样品测定
11批连翘药材分别按“含量测定”项下方法，测定其中连翘苷的含量，结果见表3.
1.3.8　柱效的测定
N=5.54(t_R/W_1/2)²=5.54×(10.747×6.6/10)²=1 468.
按连翘苷计算，理论塔板数不得少于1300.

Tab.3　Determination of philllyrin in 11 batches of samples by two HPLC methods

No.	Place of collection	NP-HPLC C/mg^.g^-1	RSD/% n=3	RP-HPLC C/mg^.g^-1	RSD/% n=3
01	Hebei	0.767 5	1.80	0.863 4	2.44
02	Henan	2.571 2	1.77	2.383 1	0.65
03	Shandong	0.382 2	2.84	0.393 8	3.47
04	Anhui	2.505 3	2.94	2.286 6	2.28
05	unknown	1.472 0	1.28	1.135 4	2.38
06	Shanxi	1.865 8	2.20	2.036 2	1.65
07	Ningxia	2.837 5	2.98	2.917 9	1.66
08	Shanxi	0.690 0	2.84	0.731 1	0.56
09	unknown	0.396 6	0.40	0.413 3	2.20
10	Yunnan	3.981 6	2.29	3.806 9	1.65
11	Beijing	3.514 9	1.75

1.3.9　对照品连翘苷及连翘药材的HPLC图谱
见图3.

Fig.3　HPLC chromatograms of the standard and sample
A—Chromatogram of the standard;B—Chromatogram of the sample

2　反相高效液相色谱法

2.1　仪器与试药
乙腈(色谱纯，中国医学科学院天津协和公司)；其它同“1.1”项下.
2.2　色谱条件
紫外检测波长的选择同“1.2.1”项下.色谱柱：ODS-C18(大连依利特公司，4.6 mm×20 cm，5 μm)；流动相：乙腈-水(体积比25∶75)；流速：0.8 mL/min；其它同“1.2.2”项下.
2.3　方法与结果
2.3.1　工作曲线的考察
精密称取连翘苷对照品5.225 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解，定容，摇匀.分别精密吸取该溶液0.5、1.0、2.0、3.0、7.0 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇溶液定容，即得对照品溶液.分别吸取对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，经计算得色谱峰面积(A)与进样量(C)之间的回归方程：A=688 166C+16 194.5，r=0.999 4.见图4.线性回归曲线说明：在0.2～2.9 μg范围连翘苷的量与色谱峰面积呈良好的线性关系，且由于其不过原点，因此，采用外标两点法测定样品中连翘苷的含量.结果见表4.

Fig.4　Linear plot of absorption against amount of phillyrin

Tab.4　Linear relationship of

absorption against amount

C/μg	A			Mean	RSD%
C/μg	1	2	3	Mean	RSD%
0.21	157206	169724	163472	163467	3.83
0.42	305856	307123	307958	306969	0.34
0.84	609228	602132	594778	602046	1.20
1.25	856590	855094	856922	855869	0.09
2.93	2015282	2056868	2035775	2035975	1.02

2.3.2　供试品的制备

　　精密称取过60目筛的本品粉末0.4 g，置于10 mL具塞刻度试管中，精密加入甲醇溶液10 mL，冷浸24 h，超声30 min，离心，吸取上清液，作为供试品溶液.
2.3.3　精密度实验
吸取对照品溶液，连续进样5次，每次20 μL，测定峰面积分别为856 590、855 094、856 922、872 430、873 284，RSD为1.06%，表明仪器具有良好的精密度.
2.3.4　回收率实验
采用加样回收法.精密称取连翘药材粉末0.2 g，共10份，分为两组，一组按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的含量，另一组加入一定量的连翘苷对照品，再同法操作，并计算回收率，结果见表5.此方法具有较好的回收率.
2.3.5　重现性实验
精密称取07号样品0.4 g 5份，按“含量测定”项下方法测定其中连翘苷的含量，结果分别为1 006 484、986 970、992 430、951 236、987 987，RSD为2.07%，此法具有较好的重现性.
2.3.6　标准品纯度检测
吸取连翘苷溶液(浓度为2.356 mg/mL的甲醇溶液)15 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，得连翘苷对照品纯度为99.87%.

Tab.5　Tests of recovery of phillyrin

No.	Added /μg	Measured /μg	Recovery /%	Mean /%	RSD /%
1	0.245 1	0.476 8	102.28
2	0.224 51	0.479 4	102.82
3	0.245 1	0.474 0	101.43	101.00	1.68
4	0.503 2	0.978 6	98.96
5	0.418 0	0.788 9	99.50

2.3.7　样品测定
10批连翘药材分别按“含量测定”项下方法，测定其中连翘苷的含量，结果见表3.
2.3.8　对照品连翘苷及连翘药材的HPLC图谱
见图5.

Fig.5　Chromatograms of the standard and sample

A—Chromatogram of standard;B—Chromatogram of the sample

2.3.9　柱效的测定
N=5.54(t_R/W_1/2)²=5.54×(20.043×4.2/6)²=4 542，按连翘苷计算，理论塔板数不少于4 000.
3　讨论
a.连翘所含成分比较复杂，药理实验表明，连翘苷具有较强的抑菌、抗病毒活性，为其有效成分之一，且含量较高，化学性质稳定，因此选择其作为指标成分对连翘药材质量进行控制.
b.从表3中数据可以看出，每批药材用两种方法测得的结果基本一致，证明了此两种方法的可行性，但又各有利弊.方法1样品处理过程比较复杂，回收率偏低；方法2虽然样品处理比较简单，但对色谱柱的损坏比较大，可根据需要选择使用.

　国家“九五”攻关项目“70种常用中药材质量标准规范化研究”子课题之一
作者单位：沈阳药科大学中药系

参考文献
1　中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：一部.广州：广东科技出版社，1995.145
2　阴健，郭力主编.中药现代研究与临床应用.北京：学苑出版社，1993.356～359
3　徐孔，沙世炎.中草药有效成分分析法.北京：人民出版社，1984.144
4　陈发奎主编.常用中草药有效成分含量测定.北京：人民出版社，1997.305～311

收稿日期:1999-01-18

作者：王伟芳徐绥绪张国刚 2007-5-18