用高效液相色谱法测定大鼠血浆中甘草次酸浓度

摘　要　采用高效液相色谱法测定大鼠血浆中甘草次酸浓度.线性范围0.36～48 mg/L.精密度(RSD)日内小于15%，日间小于16%，回收率92.2%，最低检测浓度为0.3 mg/L.

Determination of the Concentration of Glycyrrhetic Acid in Rat Plasma by HPLC

Xiang Qi,Cheng Gang,Chen Jimin
Department of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015

Abstract　The contents of glycyrrhetic acid in plasma were determined by HPLC under following conditions:column ODS 5 μm，200 mm×4.6 mm；mobil phase methyl alcohol and 5 mmol/L tetrabutyl ammonium bromide aqueous solution(V∶V=90∶10，pH 3.6);flow rate 1.0 mL/min；λ=248 nm.The result showed the minimum determination concentration of glycyrrhetic acid was 0.3 mg/L.
Key words　HPLC;glycyrrhetic acid;plasma

　　甘草次酸(glycyrrhetic acid,GA)为甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)主要成分甘草酸的水解产物.目前国内外对甘草次酸的血药浓度测定有酶免疫法^〔1〕和HPLC^〔2〕法.酶免疫法费用较高，HPLC法的流动相采用乙腈，也耗资较大.作者用甲醇-缓冲盐体系测定甘草次酸的血药浓度，具有价格低廉、方法简单、重复性好等特点，对含有甘草酸、甘草次酸的中药的药物代谢动力学研究十分有意义，也有利于传统中药的进一步深入研究与应用.

1　实验材料

1.1　实验仪器
　　Waters HPLC仪：510泵，484紫外检测器，U6k进样阀，Baseline 810色谱工作站；YKH-Ⅱ型液体快速混和器(江西医疗器械厂)；80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)；pHS-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂).
1.2　药品与化学试剂
　　甘草次酸对照品(中国药品生物制品检定所)；甘草次酸甲酯(GA-Me，本实验室自制)；四丁基溴化铵(分析纯，上海青浦新产品研究所)；甲醇(色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)；二氯甲烷(分析纯，沈阳化学试剂厂)；磷酸(分析纯，沈阳化学试剂厂).

2　实验方法

2.1　标准液的制备
　　甘草次酸标准溶液：精密称取甘草次酸12 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配成1.2 g/L的标准溶液.
内标溶液：以甘草次酸甲酯为内标物，配成甲醇溶液(20 mg/L).
2.2　血浆样品中甘草次酸的HPLC分析
　　色谱条件：色谱柱：ODS 5 μm,200 mm×4.6 mm(天津Turner科学仪器公司)；流动相为甲醇-5 mmol/L四丁基溴化铵水溶液(V∶V=90∶10，用20%磷酸调pH 3.6)；流速：1.0 mL／min；紫外检测波长：248 nm；进样20 μL.
在10 mL具塞离心试管中准确加入大鼠血浆200 μL及磷酸液(V∶V=1∶60)1 mL，摇匀后加5 mL二氯甲烷，密塞，振荡10 min，离心20 min(3 000 r/min)，吸取有机相置于60℃水浴中，N₂吹干.残渣用500 μL甘草次酸甲酯甲醇溶液(20 mg/L)溶解.吸取上清液进样20 μL.
2.3　分析方法的确证(Validation)
2.3.1　HPLC分析方法的专属性
在上述色谱条件下，甘草次酸(GA)和内标物甘草次酸甲酯(GA-Me)的保留时间分别为9.99 min和14.9 min，分离度R=2.6.柱效(理论塔板数/米)：15 045(以甘草次酸计算).图1为空白血浆、空白血浆中加入GA和GA-Me后及给药后大鼠血浆样品色谱图.由图1可知在选定的色谱条件下，空白血浆中的内源性物质对待测物及内标物的测定均无干扰.

Fig.1　Chromatography of Glycyrrhetic acid(GA)

1—GA；2—GA-Me internal standard；
A—Blank plasma;B—Blank plasma spiked with GA and GA-Me；C—Rat plasma sample

2.3.2　标准曲线
取标准溶液，用甲醇稀释成浓度为0.12 g/L，准确吸取该溶液0.6，1 μL及1.20 g/L的标准溶液2，4，8 μL至10 mL具塞离心试管中，加入大鼠血浆 200μL，同“2.2”项下操作，制备标准曲线.线性范围：0.36～48 mg/L.
上述各系列标准溶液的每个浓度平行进行3个样本的分析，重复进行3个分析批(Run).分别将所得峰高比(纵坐标y)对待测物浓度(横坐标x)采用加权最小二乘法进行线性回归计算(权重因子W_i=1/c²_i(c_i为待测物浓度)，求得直线回归方程，即标准曲线^〔3〕.表1列出了分析方法建立阶段(prestudy validation)全部3个分析批的标准曲线方程参数.
2.3.3　精密度与检测限
分别取血浆200 μL加入GA，配制成含GA 1.0、24、48 μg/mL3种浓度，按“2.3.2”项下操作，进行方法的精密度实验，实验结果见表2.RSD为相对标准偏差.

Tab.1　Parameters of the standard curve

Tab.2　Precision of the glycyrrhetic acid

　　空白血浆中加入甘草次酸标准溶液，测定1.0、24.0、48.0 mg/L 3种浓度的回收率，测得平均回收率为99.2.

Tab.3　Results of recovery(n=6)

　　中药多数经口服用，其成分的一部分在消化道内被转化，然后被肌体吸收，或吸收后被肝脏转化^〔4〕.目前研究认为甘草的药效主要由其水解产物甘草次酸产生，甘草的副作用“伪醛固酮增多症”与甘草次酸有关^〔5〕，因此测定甘草次酸的血药浓度是必要的.采用高效液相色谱法测定甘草次酸的血药浓度，快速准确，可作为甘草次酸血药浓度的有效检测方法.

作者单位:沈阳药科大学药学系，沈阳　110015

参考文献

1　吴锡铭.甘草酸铵的药动学和药效学等的研究进展.药学通报，1987，22(8)：449～453
2　Yoshikazu Yamamura.Administration-route dependency of glycyrrhizin in rats：Intraperitoneal administration dramatically enhanced bioavailability.Biol Pharm Bull,1995，18(2)：337～341
3　钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题.药物分析杂志，1996，16(5)：343～346
4　难波恒雄.肠内细菌对汉药成分的代谢(第10报)——芍药成分芍药甙代谢物的药理作用.国外医学中医中药分册,1987，9(2)：107～108
5　金建军，夏德全.甘草甜素药代动力学的研究进展.国外医学中医中药分册，1994，16(1)：13～15

收稿日期:1998-09-23