高效液相色谱法同时测定血清中头孢哌酮和舒巴坦的含量

　摘要报告了用高效液相色谱法同时测定血清中头孢哌酮和舒巴坦的含量。
本法以外标法为基础，0.5mL血清标本经甲醇沉淀蛋白，离心后上清液进样。
色谱分析条件：以C18反相柱作分析柱，流动相组成为0.005m mol/L四丁基
氢氧化铵—乙腈(825∶175，V/V)，磷酸调整pH至5.0，流速为1.0mL/min，
在紫外检测器230nm进行检测。本法的头孢哌酮和舒巴坦的最低检出浓度分别
为10mg/L和5mg/L，至少在10～1000mg/L范围内呈线性，头孢哌酮和舒巴坦的
绝对回收率分别是99.4％～102.9％和95.0％～105.3％，批内和批间RSD分别
是1.4％、1.5％和1.8％、1.9％。对10种临床常用的β-内酰胺类药物进行了
干扰实验，未发现有干扰峰。


β-内酰胺酶的产生已迅速波及到许多种类的细菌并且已经成为影响β-
内酰胺类抗生素的主要威胁［1，2］，以至许多头孢菌素对产β-内酰胺酶的
细菌并不具有“深谱”抗菌能力，舒普深(Sulperazon)内含舒巴坦钠和头孢哌
酮钠；由于舒巴坦(Sulbactam)是一种强有力的β-内酰胺酶抑制剂，而头孢哌
酮(Cefoperazone)是第三代头孢菌素类抗生素，具有广谱的抗菌作用，两者联
合具有明显的协同作用，是一种全新的广谱加上深谱的头孢菌素类抗生素，
在临床治疗中广泛使用。但如果用药不当会产生副作用或未达到合理用药的
目的。因此，测定血液中该药物的浓度，对于研究不同疾病条件下该药物的
作用机理、药代动力学以及制定合理的给药方案十分必要［3］。

用高效液相色谱法测定舒巴坦和头孢哌酮的方法已有很多报道，但绝大
多数方法是在一个色谱条件下测定一种药物，为此，笔者建立了一种能同时
测定血清头孢哌酮和舒巴坦含量的高效液相色谱法。该法在保证足够的灵敏
度、精密度和准确度的前提下，达到操作简便、节约有机溶剂、节省人力和
时间的目的。

1  测定原理

以外标法为基础，血清样品经甲醇沉淀蛋白，取上清液过滤，滤液直接
进样，用C18反相柱进行色谱分析，紫外检测器在230nm波长下进行检测，以
峰面积定量。

2  材料和方法

2.1　标本的收集和保存　抽取血液放入普通玻璃试管中(勿溶血)，分离血
清后立即测定，如不能立即测定应将血清密封，置4℃冰箱或-20℃下保存，一
周内测定。

2.2　仪器　高效液相色谱仪：包括Waters 510泵，486紫外可见光检测器，
U6K进样阀，PC800色谱工作站，AST486微机。平头微量注射器：Hamilton 25μL，
美国。样品过滤器：New Hyde Park，日本。样品过滤膜：Millipore 0.5μm，
美国。离心沉淀机：LXJ—Ⅱ型，南京第一医疗器械厂生产。

2.3　试剂　标准物：头孢哌酮(纯度为93.8％)和舒巴坦(纯度为99.5％)均
由中国大连辉瑞制药有限公司提供。溶剂：四丁基氢氧化铵和磷酸为国产分
析纯试剂；乙腈和甲醇为国产色谱试剂；水为Millipore超纯水器生产。

2.4  溶液配制

标准液：室温下分别配制浓度为1g/L的头孢哌酮和舒巴坦的甲醇溶液，
密封。置4℃冰箱保存，用前取出放至室温后使用。

血清标准应用液：参考舒普深血清药代动力学资料［4］，确定两药物标
准曲线各点的血清药物浓度(表1)。用健康正常人无药混合血清配制。将不同
浓度的血清标准应用液分装，密封，置-20℃保存，至少在二周内是稳定的。

表1 各被测药物血清标准应用液浓度(mg/L)

　　流动相：四丁基氢氧化铵溶液(0.005m mol/L，磷酸调pH至5.0)和乙腈
按825∶175(V/V)比例混合，混匀后用超声波脱气15min。

2.5　样品预处理　取所需数目的6mL圆底带塞试管，于试管中分别加入标准
血清应用液、空白无药血清和病人标本各0.5mL。于各管中准确加入甲醇0.5mL，
旋涡1min，离心(3000r/min)15min。吸取上清液过滤，取滤液20μL进样。

2.6　色谱分析条件　分析柱：Nova-PakR○C18  4μm，3.9mm×150mm，检
测波长：UV230nm，流速：1.0mL/min。柱温：室温。

2.7　计算　在PC800色谱工作站中设置好各有关参数，得出头孢哌酮和舒
巴坦的血清标准物的峰面积。以各药标准血清的峰面积为纵坐标，其相应的
血药浓度为横坐标，分别绘制各药的标准曲线。由待测标本的峰面积，在标
准曲线上查出其相应的血药浓度。亦可根据各药的峰面积与血药浓度的回归
方程，计算标本的血药浓度。

3  结果

3.1　色谱图　空白无药血清无内源物干扰，两药物均达到基线分离，头孢
哌酮和舒巴坦的出峰时间分别是3.62和7.11min，色谱分析过程在10min内完
成。色谱图见图1～4。

图1 空白血清色谱图

图2 甲醇混合标准液色谱图

A.碱性降解产物 B.头孢哌酮(500mg/L)C.舒巴坦(500mg/L)

图3 血清标准液色谱图

A.头孢哌酮(300mg/L) B.舒巴坦(200mg/L)

3.2　线性关系及线性范围　在上述实验条件下各药的血药浓度(X)与峰面
积(Y)的线性关系良好，头孢哌酮和舒巴坦的直线回归方程分别是：
Y＝835X+8750  r＝0.9996
Y＝1873.9X-6217.3  r＝0.9999
各被测药物自检出限至少至1000mg/L范围内呈线性关系。


图4 病人血清标本色谱图A.头孢哌酮(205mg/L) B.舒巴坦(166mg/L)

3.3　检出限　以引起两倍于噪音的药量为最低检出量，以经预处理后的进
样药量等于最低检出量的标本药物浓度为最低检出浓度。本法的最低检出浓
度分别是：头孢哌酮为10mg/L，舒巴坦为5mg/L。

3.4  回收率   用下列公式计算绝对回收率，结果见表2。

绝对回收率＝
(经甲醇处理后上清液药物峰面积)/(相应浓度标准液直接进样后的峰面积)
×(1)/(0.5)×100％

表2 受检药物血清样品的绝对回收率(％，n=5)

3.5　精密度　各自选择5个水平的血药浓度作批内变异，1个水平的血药浓度
作批间变异，结果如表3。

3.6　干扰实验　在上述色谱条件下，对10种临床常用的β-内酰胺类药物(氨
苄青霉素、羟氨苄青霉素、青霉素G钠盐、氧哌嗪青霉素、克拉维酸、头孢噻
肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢唑啉、头孢呋辛进行了干扰实验，均未发现
有干扰峰。

表3 受检药物的批内(n=10)和批间(n=23)相对标准偏差(％)

4  讨论

4.1　色谱体系的选择　在分析碱性药物时，多采用反相柱，它可使血液中
的内源性强极性成分快速洗脱下来，避免对测定药物的干扰，同时也缩短了
测定时间，笔者采用了C18反相柱进行分离。固定相确定以后，流动相的组分
对被测物的色谱分离起着决定性的作用，笔者曾试用甲醇(多种比例)作为流动
相中的强溶剂和采用文献［5～7］所用流动相，分离度和峰形均不令人满意，
改用乙腈作为强溶剂和用四丁基氢氧化铵作为添加剂，且按照一定比例配制
及调整pH，就获得了满意的分离度。

4.2　样品的预处理　本法样品处理操作简单、快速，试剂易得，基本上能
满足临床检测的要求，如需提高检测灵敏度，还需要将提取液进一步浓缩和重
组，然后再进样分析，此有待进一步摸索改进。

4.3方法概述和应用实例　采用本实验所设计的流动相能将舒普深中头孢哌
酮和舒巴坦完全分离，虽然舒巴坦中常含有碱性降解物，但它并不干扰本法
含量测定(见图2)；分离后虽然用外标法以峰面积计算出组分的含量。但由于
样品处理过程简单，人为影响因素少，且通过多次实验证明本法的特异性强，
灵敏度较高，重现性和回收率结果良好，与文献报道［5，7］舒巴坦和头孢
哌酮分别测定所得的线性、重现性和回收率相比该法要稍优，虽灵敏度稍差，
但各组分的测定结果均能满足临床应用的要求。另外，通过比较，无论是用
峰面积或是峰高计算结果，均无明显差别。本方法建立以后，已对临床90多
人次烧伤病人用药后的血清标本进行了测定，未发现内源性物质和药物的代
谢产物的干扰，说明本法能够满足对舒普深临床血药浓度和药代动力学监测
的要求。

参考文献

1 Acar J F.Problems and changing patterns of resistance with gram-negative bacteria.Rev
Infect Dis,1985,7(suppl 4)S:545

2 Acar J F,et al.Role of β-lactamases in the resistance of gram-negative bacilli to β-lactam
antibiotics.Rev Infect Dis,1986,8(suppl 5):S482

3 吴莱文主编.治疗药物监测.人民卫生出版社，1989.2

4 Saito A.Absorption,excretion,distribution and metabolism of sulbactam/cefoperazone,in
Ueda Y,Neu H C.β-lactamase blocking agents.Tokyo:University of Tokyo Press,1986.51

5 刘金芳等.氨砜西林注射液中氨苄西林和舒巴坦的HPLC测定.中国医药工业
杂志，1994，25(4)：172

6 Mohammad A,et al.Measurement of anoxicllin and clavulanic for injection by high-performance
liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal,1991,9(9):731

7 商  澎等.血清和组织间液中头孢哌酮的高效液相色谱测定方法.药物分析杂
志，1992，12(6)：327

　　Simultaneous Determination of the Content of
　　　　　　　　　　　　　　Cefoperazone and Sulbactam in Serum by HPLC

Zeng Liming,Huang Yudan and Tangyin

(Xiangya Hospital,Hunan Medical University,410078)

Abstract:Simultaneous determination of the content of cefoperazone and sulbactam
in serum by HPLC is reported.On the basis of external standard method,the protein
of 0.5mL serum sample was precipitated by methanol,and the supernatant was injected
into HPLC after centrifugation.The analytical column was a C18 reversed-phase column,
the mobile phase consisted of tetrabutylammonium hydroxide(0.005m mol/L) and
acetonitrile(825∶175，V/V)，pH was adjusted to 5.0 with phosphoric acid.The flow
rate was 1.0mL/min，and the detection was carried out with an ultraviolet detector
(λ＝230nm).The detection limits of cefoperazone and sulbactam were respectively
10mg/L and 5mg/L.The linearity was in the range of 10～1000mg/L.The absolute recovery
of cefoperazone and sulbactam was respectively 99.4％～102.9％ and 95.0％～105.3％.
The between-day RSD of cefoperazone and sulbactam was 1.4％ and 1.5％,and intra-day
RSD was 1.8％ and 1.9％ respectively.We did not find any interference peak from ten
commonly used β-lactam drugs.
Key words:cephalosporin sort antibiotics,β-lactamase inhibitor,HPLC