离子对液相色谱法测定复方赖氨酸颗粒剂中维生素B1和维生素B6的含量色谱论文 | 39康复网

　　摘　要　目的：建立IP-HPLC测定复方赖氨酸颗粒剂中维生素B₁和维生素B₆含量的方法。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-水相(辛烷磺酸钠0.32g,三乙胺2ml, 冰醋酸10ml, 加水至1 000ml)(13:87)为流动相,检测波长为280nm。结果：两成分的线性关系良好;6次测定的平均回收率±RSD,维生素B₁为100.58%±0.50%,维生素B₆为99.98%±0.74%。结论：本法可用于同时测定复方赖氨酸颗粒剂中维生素B₁和维生素B₆含量。
关键词　离子对色谱法;维生素B₁;维生素B₆;复方赖氨酸颗粒剂
中图分类号　R914.1

SIMULTANEOUS DETERMINATION OF VITAMIN B₁ AND VITAMIN B₆IN COMPOUND L-LYSINE GRANULES BY IP-HPLC

Miao Huizhu,Liu Yubo,Liu Yan’e
(Institute for Drug and Instrument Control of PLA,Beijing　100071)

　　Absract　AIM To establish a method using ion-pair HPLC for the determination of Vitamin B₁ and Vitamin B₆ in compound L-lysine granules.METHODS The assay was conducted on a YWG-C₁₈ coliu with acetonitrile-buffer solution (mix 0.32g sodium 1-octanesulfonate, 2ml triethylamine and 10ml glacial acetic acid,and adding water to 1000 ml)(13:87) as mobile phase. The detection wavelength was 280 nm.RESULTS Satisfactory linearity and accuracy were obtained,with the recoveries (n=6) as follows: Vitamin B₁,100.58% (RSD±0.50%); Vitamin B₆,99.98%(RSD±0.74%)。CONCLUSION The ion-pair HPLC method may be used for the simultaneous determination of Vitamin B₁ and Vitamin B₆ in compound L-lysine granules.
　　Key words　ion-pair HPLC;Vitamin B₁;Vitamin B₆;compound L-lysine granules

　　复方赖氨酸颗粒剂是由盐酸赖氨酸、维生素B₆、维生素B₁和葡萄糖酸钙等4种成分组成的复方制剂,每g中含维生素B₁(Vitamin B₁,简称VB₁)和维生素B₆(Vitamin B₆,简称VB₆)分别仅为0.0035及0.002g。由于VB₁和VB₆含量少及多种成分共存,不能采用一般的容量分析、紫外分光光度法测定。根据颗粒剂组成的色谱行为,将其用水溶解,用反相离子对色谱法同时测定颗粒剂中VB₁和VB₆两组分含量^{［1、2、3］}。

1　材料与方法
1.1　仪器与试药　(1)岛津LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津制作所);SPD-6AV紫外检测器;CR-3A系列处理机;色谱柱YWG-C₁₈(200×4mm),10μm,(大连物理化学研究所)。(2)VB₁、VB₆对照品及复方赖氨酸颗粒剂(南宁邕江制药厂，颗粒剂批号 980206，980209，980210);辛烷磺酸钠(Sigma公司提供);乙腈,色谱纯;超纯水;其余试剂为分析纯。
1.2　色谱条件　流动相　乙腈-水相(辛烷磺酸钠0.16g,三乙胺1.0ml,冰醋酸5.0ml,加水至500ml,必要时调节pH值为3.6)(13:87)。流速1.0ml^.min^-1, 柱温35℃,进样20μl。
1.3　方法　(1)柱效和分离度　以上条件测定B₁和B₆对照品溶液HPLC色谱图,理论板数按维生素B₆峰计为2404,维生素B₁和B₆峰分离度为4。重复进样,RSD小于2.0%。(2)测定波长的选择　配制VB₁水溶液(17.5μg^.ml^-1)及VB₆水溶液(10μg^.ml^-1),分别绘制紫外吸收光谱图(见图1)。选择两成分吸收曲线交叉点附近的280nm波长处，作测定波长。

图1　VB₁和VB₆紫外吸收光谱图
--VB₁　　─VB₆

2　结　果
2.1　线性关系　取VB₁和VB₆对照品适量,精密称定,用水配制成浓度分别为0.035和0.020mg^.ml^-1的对照贮备液。精密量取贮备液0.2、0.5 、1.0、1.5、2.0ml,分别置于10ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。精密量取20μl,注入液相色谱仪,以样品测定条件进行高效液相色谱测定,记录色谱图(见图2)。

图2　VB₁和VB₆ HPLC色谱图
a　空白　　b　对照品　　c　样品

　　以峰面积A对浓度C进行回归,结果见表1。

表1　VB₁ VB₆线性试验结果

VB₁		VB₆
峰面积A	浓度(c/mg^.ml^-1)	峰面积A	浓度(c/mg^.ml^-1)
40 794	6.908×10^-3	42 232	4.07×10^-3
109 776	17.27×10^-3	111 222	10.175×10^-3
238 527	34.54×10^-3	232 936	20.35×10^-3
367 838	51.81×10^-3	351 928	30.525×10^-3
495 512	69.08×10^-3	457 682	40.70×10^-3

回归方程(VB₁)
C=1.359×10^-7A+1.884×10^-3
r=0.999 9
线性范围 6.91～69.1×10^-3mg^.ml^-1
回归方程VB₆
C=8.734×10^-8A+2.712×10^-4
r=0.999 7
线性范围 4.07～40.7×10^-3mg^.ml^-1

2.2　空白样品测定　按处方配制除待测两组份外的空白样品,按样品测定方法进行高效液相色谱测定。结果在VB₁与VB₆峰位置无峰出现(见图2)，证明颗粒剂中其他组分和辅料不干扰测定。
2.3　稳定性实验　取样品溶液(批号 980206),放置不同时间按法测定VB₁和VB₆含量(进样前滤过),以考察本品溶液在24h内稳定情况,结果(见表2)在24h内测定基本一致,表明本品溶液在24h内稳定。

表2　VB₁ VB₆稳定性测定结果(%)

药　品	时间(h)
药　品	0	4	8	24
VB₁	93.5	92.0	95.9	94.0
VB₆	93.0	92.4	91.9	93.3

2.4　最小检测量　取VB₁与B₆对照品,精密称定,分别配制并稀释溶液,经HPLC测定,记录色谱图,使VB₁与VB₆峰高为仪器响应噪声的3倍量。测得VB₁最小检测量为2.1×10^-3μg；VB₆的最小检测量为4.9×10^-4μg。
2.5　回收率测定　按处方组成配制除待测组分外的空白样品,称取约1g,置于100ml量瓶中,分别精密加入VB₁和VB₆各适量。按样品测定法测定,将测得量与添加量计算得回收率，结果见表3。

表3　VB₁和VB₆回收率试验结果

药品	加入量 (mg)	测得量 (mg)	回收率 (%)	±s (%)	RSD (%)
VB₁
1	2.763	2.780	100.61
2	2.763	2.786	100.84
3	3.454	3.451	99.92	100.58±0.50	0.50
4	3.454	3.467	100.37
5	4.145	4.203	101.39
6	4.145	4.160	100.35
VB₆
1	1.575	1.568	99.56
2	1.575	1.567	99.49
3	1.969	1.974	100.25	99.98±0.74	0.74
4	1.969	1.955	99.29
5	2.363	2.394	101.31
6	2.363	2.363	100.00

2.6　精密度试验　取VB₁和VB₆对照品溶液,按法测定,共进样5次，结果(见表4)精密度良好。

表4　VB₁ VB₆测定方法精密度试验结果

序　号	峰面积
序　号	VB1	VB6
1	187 942	166 821
2	193 544	166 548
3	190 724	165 909
4	192 207	167 840
5	192 864	168 542
	191 456	167 132
RSD(%)	±1.16%	±0.63%

2.7　重现性试验　取本品约1g,5份,精密称定,分别置于5个100ml量瓶中。加水60ml,超声10min,加水使至刻度,摇匀。双层滤纸滤过为供试品溶液。以下同样品测定项下操作,计算。结果见表5。

表5　VB₁ VB₆含量测定重现性试验结果

序　号	含　　量
序　号	VB₁(%)	VB₆ (%)
1	97.8	93.9
2	96.2	93.2
3	95.8	95.1
4	98.4	94.3
5	97.1	95.0
	97.1%	94.3%
s	±1.08%	±0.79%
RSD	1.11%	0.84%

2.8　样品测定　照高效液相色谱法(中国药典1995年版二部附录VD)测定。
色谱条件与系统适用性试验　用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,乙腈-水相(辛烷磺酸钠0.32g,三乙胺2ml,冰乙酸10ml,加水至1 000ml,必要时用三乙胺或冰乙酸调节使pH值为3.6)(13:87)为流动相,流速1ml^.min^-1,检测波长为280nm。理论塔板数按VB₆峰计算应不低于2 000,VB₁峰与VB₆峰分离度应符合要求。
对照品溶液的制备　取VB₁与VB₆对照品各约35mg和20mg,精密称定,同置于100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取溶液10ml置100ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
供试品溶液的制备　取装量差异项下的内容物,混合均匀,精密称取约1g于100ml量瓶中。加水约60ml,超声5～10min,加水至刻度,摇匀。测定前滤过,取续滤液即得。
测定法　分别取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,即得。分别测定3批样品VB₁和VB₆的含量,测定结果见表6。

表6　VB₁ VB₆样品含量测定结果(n=2)

批　号	VB₁(%)	VB₆(%)
980206	93.5	92.9
980209	95.6	94.6
980210	96.4	93.9

3　讨　论
3.1　本颗粒剂中有辅形剂羧甲基纤维素钠、淀粉等,因此，水溶液(1→100)滤过后容易产生混浊或沉淀物。为使进样时的溶液澄明,建议供试品溶液应在测定前滤过。
3.2　VB₁和VB₆均为水溶性药物,由于本品中含量很少,因此，测定时能否溶出十分重要。建议配制供试品溶液时超声5～10min,使溶出完全。

作者简介：苗惠珠，女，主任药师。国家进口药品审评委员，全军新药审评委员会委员。

作者单位：中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所　北京　100071

参考文献：
1　陆帼蓉，王桂珍.RH-HPLC法测定复合维生素B片中VB₁ VB₂ VB₆和烟酰胺的含量.中国药科大学学报，1995；26(3):177
2　韩俊，徐育川.离子对液相色谱法测定活络灵胶囊中非那宗、VB₁和VB₆的含量.药物分析杂志，1997；17(2):97
3　毛舜元，杨观兆，施辛等.高效液相色谱法测定多种维生素含量.药物分析杂志，1995；15(2):25

(本文编辑　刘贺之)

收稿日期：1998-11-18
修改日期：1998-12-04

作者：苗惠珠刘玉波刘艳娥 2007-5-18