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来氟米特水溶液化学稳定性的研究

来源:中国色谱网
摘要:摘要目的:研究广泛pH范围内来氟米特的化学稳定性。方法:建立来氟米特的HPLC测定方法,测定不同温度下不同pH值时来氟米特分解的速度常数,得到不同pH值时的分解活化能及不同温度下的最稳定pH值。结果:常温(20~40℃)下来氟米特最稳定的pH范围是2。最稳定的pH范围随温度升高而向低pH值方向移动,当温度大于60℃时,最......

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  摘 要 目的:研究广泛pH范围内来氟米特的化学稳定性。方法:建立来氟米特的HPLC测定方法,测定不同温度下不同pH值时来氟米特分解的速度常数,得到不同pH值时的分解活化能及不同温度下的最稳定pH值。结果:常温(20~40℃)下来氟米特最稳定的pH范围是2.85~4.56,活化能数值恰在此范围内出现极大值。最稳定的pH范围随温度升高而向低pH值方向移动,当温度大于60℃时,最稳定pH值为1.80以下。结论:适当调整溶液的pH值可以显著改善来氟米特的化学稳定性,为其制剂学研究提供了部分依据。

 

  关键词:来氟米特  药物稳定性  经典恒温法  高效液相色谱,反相

 

  来氟米特(leflunomide,LFM)是新型的具有抗炎及免疫抑制作用的异唑类衍生物,其作用机制不同于已知的其他抗炎及免疫抑制药物,对多种自身免疫性疾病有治疗作用。Ⅱ期临床试验显示LFM治疗类风湿性关节炎效果显著,现正在欧、美进行Ⅲ期临床试验[1]。但LFM是一种前体药物,在人及动物体内转化成活性开环代谢物A77 1726(图1)[2],使LFM水溶液呈不稳定性,关于其分解的活化能(E)及最稳定pH值的研究未见报道。我们采用经典恒温法对LFM水溶液的化学稳定性进行研究,以反相HPLC法测定其含量,为新药LFM的制剂学研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和试药 Waters Maxima 820系统,包括Waters 510泵,Waters 486可变波长紫外检测器,U6K 进样器(美国Waters公司);UV-2100型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);CS501型超级恒温器(重庆实验设备厂);pH S-3D型pH计(上海三信仪表厂)。LFM(药物合成室提供);萘(色谱纯,上海试剂一厂);甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所)。其他试剂均为分析纯。
1.2 LFM供试液的配制 实验在pH1.80~7.34内进行,约每隔1pH单位作一个数据点。缓冲液按英国药典(1993年版)方法配制,pH1.80~4.56用醋酸盐,pH5.88~7.34用磷酸盐,pH精确度±0.03。配制一定pH值的15.28μg/ml LFM溶液,立即封装于2ml安瓿。

图1 来氟米特及A77 1726的化学结构
Fig 1 Chemical structure of leflunomide and A77 1726

1.3 加速实验 将供试液立即置于恒温水浴中,定时取样,每次10支,冰箱骤冷,终止反应,打碎混匀。加速实验温度为66,71,77,82及87℃,温度控制±0.5℃。
1.4 LFM的含量测定方法
1.4.1 色谱条件 色谱柱ODS C18柱(4.6mm×150mm,10μm,大连化学物理研究所),流动相为甲醇∶水∶磷酸(67∶33∶0.006),流速1.0ml/min,检测波长260nm,灵敏度0.01 AUFS,萘为内标,进样量20μl。色谱图见图2。
1.4.2 标准曲线的制备 准确配制质量浓度为16.4 μg/ml的萘储备液和质量浓度为38.2μg/ml的LFM储备液。精密量取LFM储备液0.025,0.050,0.100,0.250,0.500,1.000,2.000ml至10ml量瓶中,加入萘储备液1.000ml,用流动相稀释成0.095 5,0.191,0.382,0.955,1.91,3.82,7.64μg/ml的标准液。以LFM的质量浓度(ρ)对其与内标的峰面积比(R)进行回归,得标准曲线方程ρ=-0.0020+0.6989R,r=0.9999(n=7)。
1.4.3 供试液的含量测定 精取供试液0.2ml,加内标萘储备液0.1ml,用流动相稀释至1.0ml,进样测定。

图2 LFM和萘的HPLC图
Fig 2 HPLC of LFM and naphthalene
A:LFM;B:Naphthalene

2 结 果

2.1 不同pH值时的Arrhenius方程 实验得到不同pH时各温度下的分解速度常数k值,用lgk对1/T(T为热力学温度)回归,得Arrhenius方程,并根据方程计算出不同pH值的分解活化能E及248 K(25℃)的t1/2,见表1。

表1 不同pH时LFM分解的Arrhenius方程
Tab 1 Arrhenius equation of leflunomide for different pH values

pH Values Arrhenius equation r

E (kJ/mol)

t1/2(t/h)
1.80 lgk= 0.395 7-1.050 5×103×1/T -0.9910 20.1131 933.69
2.85 lgk=12.288 9-4.926 3×103×1/T -0.9986 94.3201 12107.13
3.76 lgk=13.055 7-5.036 0×103×1/T -0.9949 96.4205 4834.62
4.56 lgk=14.138 3-5.448 1×103×1/T -0.9904 104.3106 9838.93
5.88 lgk=12.591 9-4.661 4×103×1/T -0.9656 89.2483 778.24
6.84 lgk=14.702 6-5.166 3×103×1/T -0.9947 98.9152 298.34
7.34 lgk=13.846 5-4.831 4×103×1/T -0.9911 92.5031 161.06

2.2 不同pH值时不同温度下的速度常数k 根据Arrhenius方程推算出不同pH值时20,40,60,70,80及90℃下的速度常数k,作lgk-pH图,见图3。常温(20~40℃)下反应速度常数k出现极小值的pH值是2.85~4.56(图3),LFM的分解活化能数值亦在此范围内出现极大值(表1),此点符合化学反应动力学的一般情况,即Arrhenius方程中指前因子A(亦称频率因子)相近时,活化能高,反应速度小。LFM的分解反应速度随温度升高而加剧,稳定的pH值范围随温度升高而向低pH值方向移动,当温度大于60℃时,最稳定pH值为1.80以下(图3)。

图3 不同pH时不同温度下的速度常数k
Fig 3 Rate constant for different pH values at different temperatures
○:20℃;●:40℃;□:60℃;■:70℃;△:80℃;▲:90℃

3 讨 论

  LFM的含量测定方法国内未见报道,国外报道可采用HPLC法测定[3],但不详细。本研究选用在LFM最大吸收峰260nm附近也有较强紫外吸收的萘为内标,适当调整流动相的比例,内标萘的保留时间约9.11min,LFM的保留时间约5.92min,两峰分离完全,无杂质干扰峰,检测限达0.8ng,日内偏差和日间偏差分别为0.76%(n= 5)和0.86%(n= 5),方法回收率为99.66%(RSD=0.80%)。 降解产物A77 1726的最大吸收波长在290nm附近, 该实验条件下未出现其他的色谱峰,不干扰LFM的测定,我们将在以后的实验中建立A77 1726的含量测定方法。本法的建立为进一步开展LFM的制剂学、药代动力学、药效学等的研究提供了一种简便、可靠的分析手段。
  有关LFM水溶液的稳定性研究,由于专利或新药保护等问题,国外未见有类似文献报道。本实验发现LFM的分解是受pH值影响的一级反应,其分解活化能与pH值有关。但在pH1.80时,指前因子A和活化能E都特别小,此时活化能与其他pH值条件下的活化能不具可比性。由于活化能所反映的是速度常数k随温度T的变化率(dlnk/dT=E/RT2)[4],pH1.80时k随温度T的变化率最小,因而此时活化能亦最小,这同时说明pH1.80条件下LFM的稳定性受温度的影响最小。总之,就温度而言,LFM水溶液的最稳定pH值可取1.80或更低;但就样品的常温贮存和实验操作的一般要求而言,LFM水溶液的最稳定pH值可取2.85~4.56,此时溶液的t1/2最长。实验过程中曾对LFM在较强碱性条件下的稳定性作过观察,因其分解迅速而未做进一步的研究。

致谢 本实验得到本校药学院药剂学教研室蒋雪涛教授的指导。

全军“九五”医学科研规划重点课题,项目编号98M077

作者单位:第二军医大学长海医院药学部,上海,200433

作者简介:朱全刚,男,1968年10月生,硕士,主管药师

参 考 文 献

 [1] 朱全刚,胡晋红,孙华君.新型抗炎及免疫调节药来氟米特.中国新药杂志,1998,7(增刊):17
 [2] Silva HT,Morris RE.Leflunomide and malononitrilamides.Am J Med Sci,1997,313(5):289
 [3] Lucien J,Dias VC,LeGatt DF,et al.Blood distribution and single-dose pharmacokinetics of leflunomide.Ther Drug Monit,1995,17(5):454
 [4] 殷恭宽.药物的稳定性.见:殷恭宽 主编.物理药学.北京:北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1993.354

作者: 朱全刚胡晋红孙华君 2007-5-18
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