RP-HPLC法测定黄花乌头中关附甲素的含量

1　仪器与药品

1.1　仪器：岛津LC-10AT高效液相色谱仪，岛津SPD-10AV型紫外-可见光检测器，WDL-95色谱工作站(中科院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心)，CQ250型超声清洗器，pHS-25型数显酸度计。
1.2　药品：对照品：关附甲素由植化教研室刘静涵教授提供；供试品：共11种，由沈阳药材公司宁绍智提供。
　　试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，无水乙醚、浓氨水、三乙胺、磷酸均为分析纯。

2　实验方法

2.1　色谱条件：色谱柱：Alltech alltima C18 5 μ 150 mm×4.6 mm色谱柱和Alltechpellicular C18 refill 3 grs预柱。
　　流动相：乙腈-磷酸三乙胺缓冲液(pH 3.04)(2∶8)，流速1.0 mL/min。
　　检测波长与灵敏度：检测波长208 nm，AUFS=0.05。
2.2　样品溶液的制备：取生药粉末约1 g，精密称定，置于锥形瓶中，加10%氨溶液0.5 mL及乙醚15 mL，冷浸40 h，滤过。残渣用乙醚洗涤3次，每次5 mL，合并醚液，挥干。残渣加少量甲醇溶解，移入2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。
2.3　标准曲线的制备：精密称定关附甲素对照品约10 mg，甲醇定容至10 mL，制成浓度约为1.0 mg/mL的关附甲素对照品溶液。分别量取该对照液2.0、1.0、0.8、0.5、0.3 mL，甲醇定容至2.0 mL容量瓶，得系列关附甲素对照品溶液。在选定的色谱条件下各进样10 μL，测定峰面积，以平均峰面积A对进样量W(μ g)计算回归方程：
A=1.5415+1.6380×104W　(n=5,r=0.9998)，线性范围：1.55～10.3 μg。
2.4　精密度试验
2.4.1　进样精密度试验：取浓度约为1.0 mg/mL对照液10 μL，连续进样5次，RSD=2.9%。
2.4.2　方法精密度试验：平行称取同种药材(1997-8-24采集根)3份，依“供试品制备”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定含量，RSD=0.9%。
2.5　稳定性试验：将关附甲素对照液放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后，按上述色谱条件进行测定，其峰面积的RSD=3.3%，表明关附甲素甲醇溶液在3 h内稳定。
2.6　回收率试验：精密称取2份1997年采老根样品各2 g，分别加入浓度为0.992 mg/mL的关附甲素对照液1 mL和0.5 mL，依“供试品制备”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定含量，结果回收率为92.1%、97.2%。
2.7　样品关附甲素含量测定：分取供试品溶液进样，依法测定，按标准曲线计算含量。