高效液相色谱与荧光法测定细菌染色体碱基组成的比较

　　细菌染色体鸟嘌呤、胞嘧啶百分比(GC%)是判断细菌相似度和作为细菌分类的重要指标之一。GC%可用在DNA变性过程中于波长260 nm下测得的变性温度℃值(Tm)代入相应的公式算出。密度梯度离心也是人们常用的方法。近年来，随着分子生物学技术在医学领域应用的日益广泛，除需要准确地测定GC%，以进行细菌的分类研究外，更需要简便快速地GC%检测法，直接用于临床分离菌种的快速初步分类，或为设计聚合酶链反应(PCR)引物用于临床未知菌鉴定提供方便。本研究应用连续荧光检测法(荧光法)建立一种快速、简便测定GC%的方法，并对其稳定性、准确性和适应性与高效液相色谱(HPLC)法进行了比较。

　　一、 材料
　　1.菌株来源：9株细菌，包括嗜血流感杆菌（NCTC 8143）、嗜肺军团菌（ATCC 33152）、伤寒沙门菌（ATCC 19430）、绿脓假单胞菌（ATCC 10145）、粪产碱杆菌（ATCC 8750）、结核菌（ATCC 27294）、堪萨斯分枝杆菌（ATCC 12478）、大肠埃希菌（ATCC 11775、K12）金黄色葡萄球菌（ATCC 12600），均获自日本岐阜大学医学部微生物学教室。其中绿脓假单胞菌(ATCC 10145)、大肠埃希菌（ATCC 11775）和金黄色葡萄球菌（ATCC 12600）分别代表高、中、低GC%含量菌株，用作建立荧光法的参考菌株；HPLC法的参考菌株选用大肠埃希菌、K12。
　　2.试剂：双股DNA结合染料(SYBR Green1)为美国Eugene,Oregon产品；核糖核酸酶A及核糖核酸酶T1购自日本TaKara生物技术公司。碱性磷酸酶、磷酸二氢铵和乙腈为日本和光制药公司产品。
　　3.仪器：连续荧光检测仪为美国Idaho Technology公司产品；高效液相色谱仪为日本产品。
　　二、方法
　　1.细菌染色体DNA的分离：参见文献［1］，取2 g左右（湿重）经适宜培养基培养的细菌，悬浮于9 ml pH8.0、5 mmol/L EDTA溶液中（革兰阳性菌需另加最终浓度为1 mg/ml的溶菌酶），加1 ml 20%十二烷基磺酸钠溶液并置55℃温育30 min。此悬液再与10 ml酚-氯仿-异戊醇混合液（25:24:1）混匀，并置振荡器强力振摇20 min，15 000× g离心10 min后，取上清液于另一洁净试管，加入2倍体积的乙醇，并用玻棒提取DNA。再悬浮DNA于无菌双蒸水，-20℃保存。用于HPLC测定的DNA，则再经大剂量核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1（终浓度分别为400 U／ml和100 U／ml）进一步纯化备用^［2，3］。
　　2.荧光检测法：1 μl不同浓度的细菌染色体DNA与1 μl稀释SYBR Green 1（1∶4 000）和8 μl1/10 SSC(1/1 SSC: 0.15 mol/L NaCl, 0.015 mol/L枸橼酸钠)混合，加入毛细离心管，10 000 r/min，离心1～2 s，将毛细管置荧光检测仪的样品检测孔中，以0.1℃/s的速度升高温度达98℃且持续30 s。荧光检测仪自动记录DNA变性过程中结合的SYBR Green 1量，描绘出变性曲线和Tm峰，并自动换算出Tm值。按下列公式计算GC%。
　　GC%x= GC%r-8.567(Tmx-Tmr)+0.066(Tmx²-Tmr²), x=待测菌株；r=参考菌株。
　　3.HPLC法：10 μl（含10 μg）纯化的DNA，加热变性后，加入2 U/ml的核酸酶P1（溶于pH 5.3、含2 mmol/L硫酸锌的40 mmol/L醋酸缓冲液中）10 μl，56℃放置 60 min，加入2.4 U/ml的碱性磷酸酶（溶解于pH8.3、0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液）10 μl，37℃放置30 min。注射5～10 μl样品于HPLC加样孔中。设定20 min测定，自动算出GC%^［4，5］。HPLC的测定条件为：逆相分配 （5C18）,10～15 cm；移动相为0.2 mol/L磷酸二氢铵∶乙腈(20∶1)；选用紫外分光检出器(270 nm)，送液速度为1～1.5 ml/min。

　　1.荧光法的建立及其影响因素：该法受DNA量、SYBR Green 1和SSC缓冲液浓度的影响。在建立荧光法的过程中，我们分别选用最终量为0.05～0.2 μg(50～200 μg/ml,10 μl)的DNA，4 000倍稀释的SYBR Green 1和1/10～2倍 SSC。结果显示，高浓度DNA(100 ng/ml以上)和SSC不利于Tm峰值的形成，其最适浓度分别为50 μg/ml和1/10 SSC;若选用1～2倍 SSC则测得的Tm峰值极低，不易测量其Tm值。尽管在1/2 SSC浓度下，可获得明显的Tm峰值，但峰高仍明显低于1/10 SSC浓度时。此外，随着SSC浓度的增加，双股DNA结合SYBR Green 1的能力减弱，而Tm值增加，影响GC%检测的准确性。在上述确定的最适DNA量与SSC浓度下，分别代表低、中、高GC%含量的金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)、大肠埃希菌(ATCC 11775)和绿脓假单胞菌(ATCC 10145)经连续荧光仪检测后，均显示标准的S形热变性曲线。SYBR Green 1则以较高浓度为宜(1∶4 000)，只有在较高浓度SYBR Green 1条件下，才有可能检测到具有高GC%菌株的Tm值（表1）。

表1　双股DNA结合染料浓度对荧光法检测Tm值
的影响(X±s)

　　2.两种方法结果的稳定性比较：以9株分别代表高、中、低GC%含量的细菌(表2)为检材，比较两种方法测得的平均GC%值，结果差异无显著性（P>0.05）。其中HPLC法测得的结果与已发表的GC%值完全相符，3次测得的标准差明显低于荧光法。用荧光法检测的9株细菌GC%有4株略高于文献值。比较用两种方法检测同一菌株的结果时发现，荧光法测得的标准差（7/9）高于HPLC法，尤其是高GC%含量的菌株（表2）。

表2　两种方法测得的GC%与文献值的比较(X±s)

　　3.DNA的纯度对两种方法检测结果的影响：按常规方法提取与纯化的细菌染色体DNA，不宜直接用HPLC检测其GC%。标本中残留的RNA等明显影响GC%测定的准确性，必须用大量的核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1进一步处理。否则， 较多的杂峰将影响碱基峰的形成而使GC%的计算出现误差。有无两种酶处理，荧光法测得的Tm值和计算出的GC%值差异无显著性（P＞0.05），而HPLC法则差异有明显意义（P＜0.01）（表3 ）。

表3　细菌DNA纯度对GC%测定的影响(X±s)

　　4.结果的准确性及方法的适用性：以测得染色体DNA全部序列的菌株为标准，与两种方法测得的GC%比较。结果显示，HPLC法的准确性高于荧光法（表2 ）。

　　荧光法是应用微量多样品连续荧光检测仪的一种方法，其快速地调节和控制温度的特点，加之特异性SYBR Green 1的问世，使得连续荧光检测快速PCR法应运而生，并显示良好的应用前景^［6-8］。GC%是细菌分类与鉴定的重要指标，其检测方法已有众多研究报道，其中快速、准确的方法当数HPLC。本试验在应用荧光法建立细菌染色体GC%测定方法的基础上，检测了分别代表低、中、高GC%含量的9株细菌，并与HPLC法进行了比较。探讨了SSC和SYBR Green 1浓度与Tm值的关系。为荧光法的推广应用积累了资料。试验结果表明，SSC浓度影响双股DNA与SYBR Green 1的结合，其浓度与双股DNA结合的SYBR Green 1量成反比，且高浓度SSC不利于变性过程中形成的单股DNA与已结合的SYBR Green 1解离，干扰Tm峰值的形成和增高Tm值。
　　SYBR Green 1可特异性地结合双股DNA^［9］，而相同浓度，不同GC%含量的双股DNA结合此染料的能力各异。我们的结果表明，高GC%菌株的DNA这种结合力强于低GC%菌株。所以在用荧光法检测细菌染色体DNA GC%时，要选用较高浓度的染料以满足高GC%菌株的需要。推测SYBR Green 1与双股DNA结合的部位可能是GC或GC相关结构。
　　HPLC法检测GC%的最大优点是结果稳定可靠，但必要的前提是DNA必须高度纯化，否则将明显影响试验结果。此外，利用HPLC测定每一菌株染色体DNA GC%至少需要20 min，而荧光法一次可同时检测24株细菌，每次检测仅需5 min，且DNA标本无需特殊处理，不受残留RNA的影响。由此可见，HPLC法因其结果准确可靠，在细菌分类研究方面的应用优于荧光法；但由于荧光法简便、快速，故可优先考虑用于临床细菌学鉴定，同时可为PCR所需引物的设计及时提供受检菌株的GC%值，便于引物设计。目前，连续荧光检测仪已初步应用于临床病原的快速PCR诊断。GC%测定方法的建立,将进一步推进荧光法的临床应用范围，为临床检验工作者提供更多的方便。

作者单位：许化溪(212001 江苏省镇江医学院检验医学系)
王胜军(212001 江苏省镇江医学院检验医学系)
黄锡全(212001 江苏省镇江医学院检验医学系)
刘恭植(212001 江苏省镇江医学院检验医学系)
李娜(日本岐阜大学医学部微生物学教室)
江崎孝行(日本岐阜大学医学部微生物学教室)

参考文献

　1，Adnan S, Li N, Miura H, et al. Covalently immobilized DNA plate for luminometric DNA-DNA hybridization to identify viridans Streptococci in under 2 hours. FEMS Microbiol Lett, 1993, 106:139-142.
　2，Ezaki T, Saidi SM, Liu SL, et al. Rapid procedure to determine the DNA base composition from small amounts of Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol Lett, 1990,67:127-131.
　3，唐志毅，肖路延，罗玲，等. 一种新的高效液相色谱法选择性测定尿羟脯氨酸. 中华医学检验杂志，1999，22：210.
　4，Hou XG, Kawamura Y, Sultana F,et al. Genetic identification of members of the genus Corynebacterium at genus and species levels with 16s rDNA-targeted probes. Microbiol Immunol, 1997,41:453-460.
　5，Kawamura Y, Hou XG, Sultana F, et al. Transfer of Streptococcus adjacens and Streptococcus defectivus to Abiotrophia gen.nov. as Abiotrophia adiacens comb.nov. and Abiotrophia defectiva comb.nov., respectively. Int J syst Bacteriol, 1995,45:798-803.
　6，Desilva D, Reiser A, Herrmann M, et al. Rapid genotyping and quantification on the Light Cycler with hybridization probes. Roche Mol Biochem, 1998, 2:12-16.
　7，Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT,et al. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem, 1997,245:154-160.
　8，Wittwer CT, Herrmann M, Moss A, et al. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Bio Techniques, 1997,22:130-138.
　9，Miller SE, Taillon MP, Kwok PY. Cost-effective staining of DNA with SYBR Green in preparative agarose gel electrophoresis. Bio Techniques, 1999,27:34-36.