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薄层色谱扫描法检测氟康唑对真菌麦角固醇生物合成的影响*

来源:中国色谱网
摘要:摘要目的:用薄层色谱扫描法检测抗真菌药物氟康唑对真菌麦角固醇生物合成的影响。方法:真菌与不同浓度氟康唑温育24h后计数、称量、皂化,提取真菌中难皂化脂,薄层层析,扫描测定其中的麦角固醇和羊毛固醇含量。结果:随着氟康唑浓度的增加,真菌中的麦角固醇含量逐渐减少,而羊毛固醇含量迅速增加。当抑制85%的麦角固......

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  摘 要 目的:用薄层色谱扫描法检测抗真菌药物氟康唑对真菌麦角固醇生物合成的影响。方法:真菌与不同浓度氟康唑温育24h后计数、称量、皂化,提取真菌中难皂化脂,薄层层析,扫描测定其中的麦角固醇和羊毛固醇含量。结果:随着氟康唑浓度的增加,真菌中的麦角固醇含量逐渐减少,而羊毛固醇含量迅速增加。当抑制85%的麦角固醇生物合成时,真菌生长繁殖的受抑率也在85%左右。结论:薄层色谱扫描法能准确测定真菌中的麦角固醇和羊毛固醇含量,可用于考察抗真菌药物对真菌麦角固醇生物合成的影响,为新化合物的体外抗真菌活性筛选和作用机制研究提供了新方法。

  随着广谱抗生素和免疫抑制剂的大量使用,癌症放疗、化疗人数的迅速增加和艾滋病的广泛流行,深部真菌病正日益成为一种常见病、多发病,抗真菌药物研究也将成为未来10年极具挑战性的课题。但是,近期国内的抗真菌药物研究,主要局限于采用简单的药敏实验,通过测定药物最低抑菌浓度(MIC)来评价药物的体外抗真菌活性。这些方法虽然简便、快速,但不能反映药物的作用机制,而且由于影响因素较多,又没有统一的标准,实验重现性较差[1]。因此,建立一个新的抗真菌药物体外筛选和作用机制研究方法已是当务之急。
  麦角固醇是真菌细胞膜特有的脂质,又是其重要的结构组成成分,它在确保膜结构的完整性、膜结合酶的活性、膜流动性、细胞活力及物质运输等方面起着重要作用[2]。目前临床常用的抗真菌药物主要就是通过抑制真菌的麦角固醇生物合成来达到抑菌目的的,它们通过作用于麦角固醇生物合成通路中的不同环节,使真菌麦角固醇生物合成受阻,细胞膜结构完整性受损,从而抑制真菌的生长繁殖[3]。本研究选用临床常用的氮唑类抗深部真菌药氟康唑,使用薄层色谱(TLC)扫描法检测其对真菌麦角固醇生物合成的影响。

1 材料和方法

1.1 菌株和培养液 新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)95211由长海医院真菌室提供。沙堡氏葡萄糖琼脂培养液(SDA):按常规方法配制,含氯霉素0.1g/L,调整pH至5.6,高压灭菌后4℃保存;YEPD培养液:酵母浸膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解,加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml,定容至1000ml,高压灭菌后4℃保存。
1.2 试剂和仪器 氟康唑(fluconazole)、布替萘芬(butenafine)由本院药化教研室提供,用DMSO配成不同浓度,-20℃保存;麦角固醇、羊毛固醇和角鲨烯对照品(Sigma公司),分别用环己烷配成0.25mg/ml溶液,-20℃保存;PBS:0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4);皂化剂为新鲜配制的含15%NaOH的90%乙醇溶液;其余试剂均为国产AR级。隔水式电热恒温培养箱和THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂);Hermle-ZK364型离心机(BHG);高效薄层板HSGF254(烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂);岛津-CS930TLC扫描仪(日本岛津)。
1.3 色谱和扫描条件 展开剂:环己烷∶乙酸乙酯(4∶1),蒸汽饱和30min,展开8cm;显色剂:10%硫酸乙醇溶液喷雾,110℃显色60min。扫描条件:反射法锯齿型扫描,单波长550nm,Sx=7(Sx为校正因子),外标二点法。
1.4 方法学考察 按常规方法,考察TLC扫描法测定麦角固醇和羊毛固醇含量的精密度、稳定性、加样回收率和标准曲线。
1.5 样品制备 取新生隐球菌95211接种于SDA斜面,35℃活化1周后再接种于YEPD培养液中,35℃,250r/min振荡培养24h,活化两次,使其处于指数生长期后期,用YEPD培养液调整真菌密度至5×108个/ml。取菌液2ml于250ml锥形瓶,加YEPD培养液98ml,不同浓度DMSO药物溶液100μl,35℃,200r/min振荡培养24h后用血细胞计数板计数。2000×g离心8min,PBS洗涤两次至上清液无色,去上清,称各菌湿质量。各精密称取湿菌约0.5g,加PBS2.5ml和皂化剂6ml,混匀,80℃水浴皂化60min。加石油醚(沸程30~60℃)6ml提取3次,合并提取液,加水6ml洗涤,醚层于60℃水浴挥干,得难皂化脂(nonsaponifiablelipids,NSLs)[4],加环己烷使溶液体积为1ml/g湿菌,-20℃保存。
1.6 样品测定和计算 分别取对照品及各样品溶液点于薄层板上展开显色,扫描测定各样品中麦角固醇和羊毛固醇的质量分数。经药物作用后新增麦角固醇质量分数按下式校正:

w=(w′×m-w0×m0)/(m-m0)

w:新增麦角固醇质量分数(mg/g菌);w′:反应后麦角固醇质量分数(mg/g菌);w0:反应前麦角固醇质量分数(mg/g菌);m:反应后真菌质量(g);m0:反应前真菌质量(g)
1.7 统计学处理 组间差异用t检验

2 结 果

2.1 真菌NSLs各成分分离效果 在本实验条件下,真菌NSLs样品经高效硅胶板层析展开后,可得5个分离效果较好的斑点(图1)。麦角固醇、羊毛固醇和角鲨烯的Rf值与对照品一致,其中麦角固醇和羊毛固醇Rf值适中,可作定量扫描。根据文献[5,6],另外两个斑点分别为4-单甲基甾醇和角鲨烯环氧化物。


1 氟康唑和布替萘芬对真菌NSLs各成分的影响
Fig 1 Effect of fluconazole and butenafine on
the components of NSLs from fun gi
1: Standard; 2: Blank; 3: Fluconazole; 4: Butenafine

2.2 氟康唑和布替萘芬对真菌NSLs各成分的影响 10μg/ml氟康唑和布替萘芬分别作用于真菌后,都能使真菌中的麦角固醇含量显著下降(图1),但经氟康唑作用后,真菌中羊毛固醇和角鲨烯环氧化物含量有不同程度的增加,而布替萘芬在降低真菌中麦角固醇含量的同时,也使羊毛固醇、4-单甲基甾醇和角鲨烯环氧化物降至痕量,只有角鲨烯得到大量积累。
2.3 精密度 扫描精密度:对同一斑点重复扫描,其扫描积分值重现性较好,RSD≤1.88%(n=6)。板内精密度:在同一薄层板上展开同一样品,各斑点扫描积分值重现性也较好,RSD≤6.22%(n=6)。板间精密度:在不同薄层板上展开同一样品,各斑点扫描积分值RSD<20%。
2.4 稳定性和回收率 样品经薄层展开、显色后,分别于1,2,3,4,6,9,12,24h扫描测定,各斑点扫描积分值在12h内RSD≤2.77%(n=7),24h内RSD≤3.64%(n=8)。麦角固醇和羊毛固醇的加样回收率(±s)分别为(95.2±7.1)%和(97.2±4.1)%(n=4)。
2.5 标准曲线 麦角固醇对照品在0.25~5μg内m=-0.165+8.700×10-5A(r=0.9988),羊毛固醇对照品在1~5μg内m=0.229+3.568×10-4A(r=0.9979)。上述两式中m为对照品点样量(μg),A为扫描积分值。
2.6 氟康唑对真菌生长繁殖和麦角固醇生物合成的影响 经0.01,0.1,1,10μg/ml氟康唑作用后,真菌的生长繁殖抑制率分别为(24.5±3.6)%,(80.2±2.2)%,(85.2±1.4)%,(91.3±1.3)%,与对照品(0±6.4)%相比,P<0.01。同时,TLC扫描结果显示,随着氟康唑质量浓度的增加,真菌中的麦角固醇含量逐渐减少,而羊毛固醇含量迅速增加(图2)。当氟康唑质量浓度为1μg/ml时,其对真菌麦角固醇生物合成的抑制率达85%,此时其对真菌生长繁殖的抑制率也在85%左右。


2 氟康唑对真菌麦角固醇和羊毛固醇生物合成的影响
Fig 2 Effect of fluconazole on ergosterol ()
and lanosterol (
) biosynthesis in fungi
**P<0.01 vs blank; n=4

3 讨 论

  近10年来,临床最常用的抗真菌药物主要有两性霉素B、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和特比萘芬[7],它们无一例外都是针对真菌细胞膜上的特有脂质--麦角固醇来发挥其抗真菌作用的。其中,除了两性霉素B是通过与麦角固醇特异性结合,破坏真菌细胞膜结构,从而起到抗真菌作用外,其余都是麦角固醇的生物合成抑制剂。如氟康唑、酮康唑和伊曲康唑等氮唑类药物都为羊毛固醇14α-去甲基化酶抑制剂,而特比萘芬则能抑制角鲨烯环氧化。新近用于临床,对皮癣菌病有特效的布替萘芬也是角鲨烯环氧化酶抑制剂[8,9]。这类药物虽然作用于麦角固醇生物合成过程中的不同环节,但最终都能使真菌中的麦角固醇含量下降,同时,引起相应上游成分的累积。因此,如能测定比较真菌中麦角固醇及其上游成分的含量,考察真菌经药物作用后上述各成分的含量变化,便可研究抗真菌药物的体外抑菌活性和作用机制。
  将真菌皂化后用石油醚提取,所得NSLs中含有麦角固醇及其生物合成过程中各中间产物,如羊毛固醇、4-甲基甾醇、角鲨烯和角鲨烯环氧化物等。本实验选用高效硅胶G板,通过薄层层析,能较好分离真菌NSLs中的各个成分,且能通过观察各个成分的斑点大小来判断药物的作用机制。如布替萘芬为角鲨烯环氧化酶抑制剂,因此,经布替萘芬作用后,真菌中角鲨烯含量明显增加,而角鲨烯环氧化物、羊毛固醇和麦角固醇等下游成分的含量显著下降;氟康唑阻断的则是羊毛固醇14α-去甲基化酶,所以在降低真菌中麦角固醇含量的同时,能使羊毛固醇、角鲨烯及角鲨烯环氧化物等上游成分有不同程度的累积。可见,用薄层色谱法能方便、快速地判断这类抗真菌药物的作用机制。
  在本实验层析条件下,麦角固醇和羊毛固醇的Rf值适中,斑点清晰,经方法学考察,用TLC扫描法能快速、准确地测定其含量。新生隐球菌经不同浓度氟康唑作用后,提取NSLs,经薄层色谱分离扫描,发现随着氟康唑浓度的提高,真菌中的麦角固醇含量逐渐减少,而羊毛固醇含量迅速增加,两者的含量变化均有明显的剂量依赖性,符合羊毛固醇14α-去甲基化酶抑制剂的作用特征。而且,当氟康唑抑制真菌麦角固醇生物合成达85%时,其对真菌生长繁殖的抑制也在85%左右,证明真菌中麦角固醇含量的下降会直接影响真菌的生长繁殖,说明麦角固醇作为真菌细胞膜的重要结构组成成分,对真菌的生长繁殖具有重要作用。因此,通过测定真菌中麦角固醇、羊毛固醇含量,不仅有助于研究抗真菌药物的作用机制,而且还可以定量考察药物的抗真菌活性,为新化合物的体外抗真菌活性筛选和作用机制研究提供了新方法。
  由于角鲨烯和甾醇的极性相差较大,所以实验中未能将其Rf值调整到适当范围内,故无法对其进行准确的定量测定。如何做到同时测定真菌中麦角固醇、羊毛固醇和角鲨烯的含量,为抗真菌药物研究提供更方便、更快速的新方法,还有待进一步研究。

* 国家自然科学基金资助项目,批准号 39870869;军队“九五”医药科研规划重点课题,项目编号 96 Z030;上海市科技发展基金资助项目,项目编号 98ZB14035

作者简介:曹永兵,男,1971年7月生,硕士生

作者单位 曹永兵 姜远英 殷 明 第二军医大学药学院药理学教研室,上海,200433;
  孙福红 海军 第401医院药剂科;
  张万年 第二军医大学药学院药物化学教研室

参考文献
1 喻 楠,王端礼,李若瑜. 抗真菌药物的敏感试验方法及各种因素对MIC值影响 的研究进展. 宁夏医学院学报,199719(1): 31
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 何秀萍,张博润. 微生物麦角固醇的研究进展. 微生物学通报,199825(3): 166
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 侯幼红. 抗真菌药物作用机理的研究进展. 国外医学*皮肤性病学分册,1993, 19(6): 341
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 Venkateswarlu K, Denning DW, Manning NJ, et al. Comparison of D0870, a new triazole antifungal agent, to fluconazole for inhibition of Candida albicans cytochrome P450 by using in vitro assays. Antimicrob Agents Chemother, 1996, 40(6): 1382
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 Guan J, Stehmann C, Ellis SW, et al. Ergosterol biosynthesis in a cell-f ree preparation of Penicillium italicum and its sensitivity to DMI fungicide s. Pesticide Biochem Physiol, 1992, 42: 262
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 Kauffman CA, Carver PL. Antifungal agents in the 19 90s. Drugs, 1997, 53(4): 539
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 McNeely W, Spencer CM. Butenafine. Drugs, 1998, 55(3): 405
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 Iwatani W, Arika T, Yamaguchi H. Two mechanisms of butenafine action in Can dida albicans. Antimicrob Agents Chemother, 1993, 37(4): 785

作者: 曹永兵姜远英殷明孙福红张万年 2007-5-18
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