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重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）高效表达时，往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体，即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0mol/L盐酸胍、8.0mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。
目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是：（1）复性效率低。传统的复性方法稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍，甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5~20%，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化。（2）工艺路线烦琐，生产周期长。在传统的重组蛋白质分离纯化工艺中，大多采用经典的软凝胶分离介质，由于这种介质的颗粒较大，分离效率较差，因此常常需要采用多种不同模式的色谱操作联用对目标蛋白质进行纯化，才能得到纯度符合一定标准的目标蛋白质。另外，这种色谱介质的耐压性很差，只能在流速较低的情况下进行操作，分离纯化时间较长。分离纯化步骤多和分离时间长使得蛋白质的质量回收率和活性回收率很低。而且在传统的重组蛋白质生产工艺中，蛋白质的复性和纯化是生产过程中两个独立的单元操作，也在很大程度上制约着生产效率。（3）生产成本高，设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高。随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。
1991年耿信笃教授首先将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性，很好的解决了上述问题，现已成功用于重组人干扰素-g(rhIFN-g)、重组人干扰素-a(rhIFN-a)、人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人胰岛素原(proinsulin)、重组牛朊病毒(prion)等重组蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等标准模型蛋白的复性与同时纯化中。目前，排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也已用于蛋白质的复性和同时纯化中。与传统的稀释法及透析法比较，用色谱法进行蛋白复性的优点是：①在进样后可很快除去变性剂；②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附，可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生，从而提高蛋白质复性的质量和活性回收率；③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；④便于回收变性剂，以降低废水处理成本。简言之，色谱法复性可以提高蛋白质的活性和质量回收率，将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成，缩短了操作步骤和生产时间，减少了设备投资，使生产成本大大降低，已经引起了全世界范围内许多生化研究者和重组蛋白药物生产厂家的关注。由于高效液相色谱（HPLC）分离效率高，往往在一步操作中便可得到纯度符合要求的蛋白质，而且分离速度快，在应用方面具有更大的优势。
精纯化2
精纯化1
除盐
成品
复性（稀释或透析）
提取
发酵
粗纯化
图1用制备型USRPP缩短重组蛋白下游工艺示意图
以下介绍一些相关文献的摘要，全文可来函索要，陕西西大科林基因药业有限公司
Purification of recombinant bovine normal prion protein PrP(104–242) by HPHIC
Chaozhan Wang, Xindu Geng, Dawei Wang, Bo Tian, Journal of Chromatography B, 806 (2004) 185–190
Purification of the prion protein (PrP) is a major concern for biological or biophysical analysis as are the structural specificities of this protein in relation to infectivity. A simple and efficient method for purification of recombinant bovine normal prion protein containing residues 104–242, PrP(104–242) expressed in Escherichia coli by high performance hydrophobic interaction chromatography (HPHIC) was presented in this work. The solution containing denatured and reduced protein in 8.0 mol/L urea extracted from the inclusion body was directly injected into the HPHIC column, aggregates were prevented by the interaction between the denatured PrP(104–242) molecules and the stationary phase during the chromatographic process, the soluble form of PrP(104–242) in aqueous solution was obtained after desorbed from the column. Several factors, including pH value, types of stationary phase and salt, and gradient mode, influencing the purification results were investigated. Optimal conditions were obtained for the purification of PrP(104–242) by HPHIC. This procedure yield PrP(104–242) of a purity of 96% with a recovery of 87%, respectively, for a single step purification of 40 min.
Refolding of Denatured/Reduced Lysozyme Using Weak-Cation Exchange Chromatography
Yan WANG, Bo Lin GONG, Xin Du GENG， Chinese Chemical Letters, 14 (2003) 828 – 831
Oxidative refolding of the denatured/reduced lysozyme was investigated by using
weak-cation exchange chromatography (WCX). The stationary phase of WCX binds to the reduced lysozyme and prevented it from forming intermolecular aggregates. At the same time urea and ammonium sulfate were added to the mobile phase to increase the elution strength for lysozyme. Ammonium sulfate can more stabilize the native protein than a common eluting agent, sodium chloride. Refolding of lysozyme by using this WCX is successfully. It was simply carried out to obtain a completely and correctly refolding of the denatured lysozyme at high concentration of 20.0 mg/mL.
High-performance hydrophobic interaction chromatography as a tool for protein refolding
Xindu Geng and Xiaoqing Chang, J. Chromatogr., 599 (1992) 185-194
A method for the refolding of previously unfolded proteins with a concentrated solution of denaturing agent is presented, involving the use of high-performance hydrophobic interaction chromatography (HPHIC) to separate the denaturing agent completely from the unfolded protein and to provide a suitable environment for its refolding. The retention, peak shape and peak height in HPHIC and size-exclusion chromatography, UV spectra, circular dichroic spectra and bioactivity were used to test the possibility and the completeness of the protein refolding. The proposed method permits the extracted solution from Escherichia coli cells to be injected directly into the HPHIC column and, at the same time, the refolding and purification of the proteins to be effected. The renaturation and purification of recombinant human interferon‑g form E. coli cells is one example of the application of the method in biotechnology.
疏水色谱法的进展及其在生化研究中的应用
刘彤, 耿信笃, 色谱, 1998, 16 (1) : 30-34
着重评述了疏水色谱法的理论研究及疏水固定相中无机填料、有机填料、非多孔填料以及大孔膜的新发展，并对疏水色谱法在生物大分子的分离、纯化和生化研究中的应用,包括在蛋白质复性、折叠和分子构象变化等方面的应用作了介绍，全文包括62篇文献和一张表格。
多功能蛋白增活器的研制及性能研究
刘彤, 耿信笃, 西北大学学报(自然科学版), 1999, 29 (2) : 123-126
自制了一种新型的多功能蛋白增活器，它具有同时除变性剂、分离杂蛋白、复性目标蛋白及便于回收变性剂的功能。考查了其对蛋白的分离、复性性能。发现这种多功能蛋白增活器可对6种标准蛋白进行良好地分离。同时对盐酸胍变性的溶菌酶和核糖核酸酶完全复性。通过测定压力-流速曲线，发现多功能蛋白增活器的压力均远远低于普通色谱柱。将其应用于基因工程发酵的粒细胞集落因子(G-CSF)的分离纯化，可使纯度接近于100%，生物活性大于常规方法3倍。
蛋白的色谱复性及同时纯化
郭立安, 耿信笃, 生物工程学报, 2000, 16 (6) : 661-666
对近年来新发展的用液相色谱(ＬＣ)进行蛋白质复性及同时纯化的方法做了评述，详细介绍了蛋白质在4种液相色谱上的复性及同时纯化的方法、设备和影响因素，并对各自的优缺点进行了比较，为色谱法作为研究蛋白质折叠及用于基因工程生产治疗蛋白质的复性及同时纯化技术的进一步应用提供依据。
用疏水色谱对还原型胍变性牛胰岛素的折叠特性研究
白泉, 孔宇, 耿信笃, 高等学校化学学报, 2002, 23 (8) : 1483-1488
用疏水相互色谱(HPHIC)对还原胍变性牛胰岛素在疏水界面上的折叠与复性进行了研究。结果表明，采用普通流动相时,对还原胍变胰岛素的复性效果较差，而采用氧化型流动相可使其复性效率提高到66%，并用反相色谱(RPLC)、紫外吸收光谱、荧光光谱及MALDI-TOF对其复性效果进行了验证。同时与体积排阻色谱(SEC)和稀释法对还原胍变胰岛素的复性结果进行了比较。结果表明，SEC根本无法使还原胍变胰岛素复性，而稀释法的复性效率仅有2%。这进一步表明HPHIC是变性蛋白复性的有效工具，变性蛋白在疏水界面折叠过程中，蛋白质与固定相之间的疏水相互作用对蛋白折叠起着关键性的作用，是蛋白折叠的主要驱动力。
中国科学, 2002, 32 (5) : 460-471
用疏水色谱复性并同时纯化蛋白质的机理及其应用
耿信笃, 白泉
变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有与疏水色谱固定相（STHIC）颗粒相互作用的倾向，两者之间的疏水相互作用能够抑制变性蛋白分子之间的相互聚集，同时疏水色谱固定相还能在分子水平上给变性蛋白分子提供足够高的能量，使其瞬时脱水并折叠成其天然构象或不同的折叠中间体。变性蛋白在疏水界面上的折叠不仅取决于其氨基酸之间的特异性相互作用及疏水色谱固定相的结构，而且还取决于固定相和流动相之间的协同作用。同时，还提出了高效疏水相互作用色谱（HPHIC）进行蛋白折叠的机理及其进行蛋白折叠时就能实现质量控制的原理。在适当的色谱条件下，HPHIC可使几种变性蛋白一步实现复性及同时纯化。此外，还设计制造出了直径比柱长大得多的实验室型和制备型“变性蛋白复性及同时纯化装置，USRPP”，该“装置”具有完全除去变性剂、使蛋白质复性、与杂蛋白分离及易于回收变性剂的“一石四鸟”功能。该“装置”对变性蛋白的复性和纯化效率与通常使用的长柱相当。在制备规模情况下，该“装置”可以在低压梯度条件下简便、快速、而经济地应用于重组蛋白药物的制备。文中以重组人干扰素-g为例，说明了制备型“装置”在其复性及同时纯化生产工艺中的应用。
高效疏水作用色谱法对还原变性溶菌酶的折叠研究
王彦, 耿信笃, 色谱, 2003, 21 (3) : 218-221
首次用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)研究了还原变性溶菌酶(Lys)的复性。对还原变性Lys在3种疏水性不同的色谱柱上的复性情况进行了考察，发现还原变性Lys在疏水性最弱的XDM-GM1型色谱柱上的复性效率最高，当Lys质量浓度为2 0 g/L时，其复性效率可达到94.6%。
Studies on renaturation with simultaneous purification of recombinant human proinsulin from E. coli with high performance hydrophobic interaction chromatography
Quan Bai, Yu, Kong, Xindu Geng, Journal of liquid chromatography & related technologies, 26 (2003) 683-695
The renaturation with simultaneous purification of recombinant human proinsulin (rh-proinsulin) expressed in E. coli by high performance hydrophobic interaction chromatography (HPHIC) was investigated. The result indicates that the reduced/denatured rh-proinsulin, extracted with 8.0 mol/L urea solution in the presence of b-mercaptolethanol can be renatured and purified, simultaneously, in 45 min with HPHIC, resulting in the purity and mass recovery being more than 90% and 94%, respectively. The disulfide bonds of rh-proinsulin can correctly form on the HPHIC column without the presence of reduced and oxidized glutathione (GSH, GSSG). The renaturation efficiency of rh-proinsulin with HPHIC was tested by enzyme cleavage in order to obtain insulin. The result was also confirmed with RPLC, SDS-PAGE, and MALDI-TOF, respectively. The renatured and purified rh-proinsulin can directly be enzyme-cleaved in the collected fraction containing the rh-proinsulin. Thus, the technology for the renatured and purified rh-proinsulin is very simple and fast.