水稻蛋白质组学

      蛋白质组 (Proteome) 术语由澳大利亚科学家1994年提出并被定义为：基因组 (Genome) 表达的全部蛋白质。随着几种模式生物基因组测序的完成，蛋白质组学 (Proteomics) 成为功能基因组时代重要的研究手段。与一些简单的原核生物相比，植物蛋白质组学研究相对落后，在拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 和水稻 (Oryza sativa) 的基因组序列公布后，植物蛋白质组学研究逐渐活跃起来。1999年首篇植物蛋白质组学综述了此前蛋白质组学在植物方面的研究进展，其中大部分研究还不曾涉及用质谱技术鉴定蛋白质，如今质谱已经成为蛋白质组学研究的重要工具。随着蛋白质组学研究范围的拓展，不再局限于单纯分离新的蛋白质，蛋白质组学现已成为描述和分析一个生物体的蛋白质，蛋白质间的相互作用以及蛋白质修饰的学科。

       水稻基因组由 430 Mb 个碱基组成，在禾谷类中较小，由于其基因易于操作，与其他单子叶植物有共线性，从而成为单子叶植物研究的模式生物。2002年水稻栽培品种籼稻和粳稻基因组框架图绘制完成，同年底水稻基因组精细图谱完成，然而从 mRNA 转录到蛋白质的翻译并不是简单的对应，真正执行生命功能的是蛋白质，蛋白质组学则将基因组序列信息与特定组织器官中蛋白质的种类连接起来。目前水稻蛋白质组学的研究逐渐掀起热潮。

      　　1　蛋白质组学研究方法
      　　蛋白质组学经典的研究方法是双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Two-dimensional PAGE，简称2-DE)技术。1975年 O''''''''Farrell 首次使用该技术分离大肠杆菌的蛋白质，后来发展的固相 pH 梯度 (IPC) 技术，解决了 2-DE 中 pH 梯度的不稳定性，Gorg 等。详述了聚焦参数的选择。双向电泳后的凝胶经过染色(如银染、考马斯亮蓝染色等)，然后用图谱软件分析及后续的质谱或氨基酸序列等分析，再通过数据库检索最终达到鉴定蛋白质的目的。目前商品化及非商品化的图像分析软件相当多，如 PD Quest，Melanie，Image 2D Elite，Z3，Progenesis 等。

      　　质谱 (Mass Spectrometry) 原理是将蛋白质样品分子离子化，然后通过质荷比分离并确定其分子量。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 和电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 两项软电离技术的出现，促进了蛋白质高通量的鉴定研究。近来出现的 MudPIT 多维蛋白质鉴定技术，将蛋白质混合物使用两向分离技术进行分离，第1向使用强阳离子交换，第2向使用反向色谱，然后用质谱鉴定。与普通的 2-DE 方法独立互补，代表了当前最丰富的蛋白质分离鉴定技术。另外出现的 DIGE 技术 (差异显示凝胶电泳)，用3种不同的荧光染料  (Cy2，Cy3，Cy5)标记不同的样品，在同一块凝胶上电泳，通过不同波长的激光及发射过滤器扫描，产生3种不同颜色的荧光信号。克服了不同凝胶间电泳造成的蛋白点的位置和量的差异，减少了凝胶使用量，增加了凝胶间的可比性。

      　 目前蛋白质组学研究出现的许多新技术，大有取代 2-DE 的趋势，但考虑到试验费用，应用能力以及使用的广泛性，2-DE 依然有前景，特别是与免疫检测结合使用，其仍然是蛋白质组学研究的重要工具。功能蛋白质组学研究涉及蛋白质的活性，因此需考虑翻译后修饰及蛋白质问的相互作用，蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质间的相互作用而实现的。目前用来检测蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交系统法，蛋白质芯片法，噬菌体展示技术等。

      　　2　蛋白质组学在水稻中的应用
      　　1)发育的蛋白质组学研究。在蛋白质组学概念提出来之前，许多研究者就已采用 2-DE 技术对水稻各组织器官的蛋白质组分进行分离及比较，Komatsu 等用 2-DE 分析水稻胚、胚乳及叶的蛋白质，考马斯亮蓝染色后分别检测出约600、100、150个蛋白点，通过 N 端或内部氨基酸测序，鉴定了27种蛋白质，超过70％的蛋白质 N 端封闭。Tsugita 等对水稻10种组织器官分离出4892个蛋白质，对其中2.8％的蛋白质进一步分析，只有1.1％(56个)测序，由于当时基因组及蛋白质数据库有限，即使一些被测序的蛋白质也不知其功能。水稻重要的繁殖器官花药在小孢子早期发育易受环境影响，Imin 等通过 2-DE 分离、银染得到约4000种花药蛋白，代表了整个基因组的10％，其中53个点得到鉴定，大部分是持家蛋白，分子伴侣，富甘氨酸蛋白，以及调控翻译的肿瘤蛋白(首次在花药研究中报道)等。同时，一些与代谢密切相关的亚细胞结构也开展了蛋白质组学研究，如水稻线粒体，通过质谱分析鉴定了149个蛋白，并确定了其中85个蛋白质的功能。在制备亚细胞蛋白质样品时，如有必要可先用显微激光切割技术进行专一样品的富集后再进一步裂解。其他涉及研究的亚细胞结构还有质膜，高尔基体膜，叶绿体等。目前水稻蛋白质组数据库包含了23张参考图，有详细的采样部位、样品制备及电泳条件，鉴定方法，点击蛋白点链接相应的信息等 (http:\\gene64.dna.affrc.go.jp/rpd/)。建立高质量的水稻 2-DE ,参考图谱对水稻蛋白质组学以及水稻基因组功能的精确注释是非常重要的。

      　　2)在环境胁迫下的蛋白质组学研究。基因的表达受各种环境因子的影响，主要包括生物和非生物因子胁迫等。用各种胁迫处理水稻，可以分离新的蛋白及基因，同时可深入了解水稻对这些环境胁迫的适应机制。水稻对干旱胁迫相当敏感，干旱严重影响水稻的产量。Salekdeh 等对干旱胁迫下以及恢复灌溉后水稻叶片蛋白质组进行分析，发现干旱胁迫下有42个蛋白点的丰度有显著变化，从而鉴定了一些干旱应答蛋白，这将有助于提高水稻抗旱育种以及改善作物品质和提高产量。Agrawal 等采用 2-DE 结合氨基酸测序及免疫杂交技术研究臭氧胁迫下水稻幼苗叶蛋白的表达，与对照相比，50多个点有差异，其中与光合作用相关的主要蛋白 RuBisCO 减少，另外诱导出与防御有关的蛋白累积，包括  OsPR5，OsPR10，SOD，APX，钙结合蛋白等，这些蛋白可以作为潜在的分子标记检测水稻及其他植物与臭氧胁迫相关的损伤。同样，金属胁迫也会对光合作用产生破坏，造成 RuBisCO 大、小亚基断裂以及影响防御相关蛋白质的表达，如 OsPR5，OsPR10，SOD。

      　  Kim 等用水稻病原菌对水稻悬浮培养细胞进行处理，诱导产生了病原相关蛋白 OsPR10，异黄酮还原酶类似蛋白 OsPR10，β-葡聚糖酶等蛋白进行了首次报道。水稻黄斑驳病毒 (RYMV) 对水稻产量的影响，Ventelon-Debout 等对两个水稻品种 IR64 (对该病毒敏感)和 Azucena (相对不敏感)的悬浮培养细胞蛋白质组的研究表明，病毒感染后两者分别有40和24个蛋白点表达有明显变化，有些只在 IR64 中表达，如 HSP70，PR-10a，乙烯诱导蛋白等，有些只在后者中存在，如 Chaperonin CPN60-2 等，而与糖酵解有关的酶在两个品种中都有变化。

      　　Rakwal 等用茉莉酸 (JA) 处理水稻，叶和茎外观上表现为相关的组织坏死，RuBisCO 亚基大量减少，茎中出现一种新的28 KD 的碱性蛋白酶抑制剂及一种酸性的17 KD 的病程相关蛋白，这些蛋白在植物的自我防御中起到了潜在的作用。Shen 等用赤霉素处理水稻叶鞘，发现表达变化的钙网蛋白参与赤霉素信号调节叶鞘的伸长。还有其他的植物激素及生长物质如：脱落酸、水杨酸、乙烯等处理水稻后再用蛋白质组学进一步研究特异蛋白的表达。

      　　3)突变体的蛋白质组学研究。突变体是遗传学研究的重要材料，通过正求遗传学研究可以找到产生突变性状的基因。而将突变体与野生植株的蛋白质组进行比较研究，可直观地将差异表达的蛋白呈现出来，进一步研究这些蛋白质有助于揭示突变体的生理生化及遗传机制。

      　　Komatsu 等对水稻绿色和白化幼苗的蛋白质通过 2-DE 分离，N-端及内部氨基酸测序，发现参与光合作用的蛋白质只在绿苗中出现，在白化苗中以前体存在不能参与光合作用；抗坏血酸过氧化物酶只出现于白化苗中，起到细胞保护的作用。叶绿素突变体有利于研究高等植物光合作用，叶绿体遗传与发育等。王玉忠 等对温敏失绿突变体水稻失绿前后的 2-DE 图谱比较表明，失绿部分某蛋白 P1 特异缺失，而在复绿后，P1 正常表达，推测该蛋白与叶绿素代谢密切相关。温敏核不育水稻是两系核不育水稻重要的育种材料，低温下才可育。谢锦云 等对不育和可育花药样品通过 2-DE 分离，肽质量指纹谱分析及数据库检索，从不育到可育图谱上，明显上调的蛋白质包括几丁质酶，酸性磷酸酶，谷蛋白前体等，明显下调的蛋白有谷氨酸氨甲酰转移酶等。模拟病斑突变体  (Lesion Mimic Mutant) 通常能在无病原物存在的情况下产生系统性过敏性坏死斑，并表现出对多种病原物抗性的提高。Tsunezuka 等对一种 cdr2 突变体的3个病斑形成阶段用 2-DE 分离，与野生型相比，有37个蛋白点差异表达，其中28个点在突变体中表达上调，9个点表达下调，通过质谱鉴定，差异表达的蛋白点与防御作用相关。此外有27个蛋白为代谢酶类，暗示该突变体发生的细胞程序化死亡与活跃的代谢有关。
      　　现代生命科学研究与生物信息学的发展关系密切，生物信息学不仅仅是收集数据，更重要的是处理、分析、解释及开发应用这些数据。目前各类核酸序列数据库、基因组数据库、蛋白质序列及结构数据库等日益完善，为迅速准确地研究和鉴定蛋白质奠定了基础。蛋白质高通量地鉴定除了需要精密的质谱仪器及相关的硬件支持外，最终的鉴定结果与各大数据库直接相关。网上提供的相应软件支持在线的鉴定，通过同源匹配得分值排序从而鉴定蛋白质的归属，当然这种检索的成功率与蛋白质物种来源的各种信息数据库的积累直接相关。水稻蛋白质组学研究相关的主要网站有：SWISS-2DPAGE 数据库中国镜像站点 (http://cn.expasy.org/ch2d/,)，提供双向电泳参考图谱及在线检索软件等；水稻蛋白质组数据库 Rice Proteome Database (http://gene64.dna.affrc.go.jp/rpd/,)；水稻花药蛋白质组图谱网站 (http://semele/anu.edu.au/2d/2d.html,)。
      　蛋白质组学研究的关键问题是分离混合蛋白的重复性和分辨率，鉴于传统 2-DE 的某些局限性(如：碱性蛋白，膜蛋白，疏水蛋白等分离效果有所欠缺)，新技术的出现和应用是必然的。2-DE 目前的蛋白质分离科学中仍然占据重要的位置，与其他具快速、高通量特征的方法相互补充将是当前及未来相当长时间内研究蛋白质组的一种趋势。
      　　目前已经建立了一些水稻蛋白质组的数据库，包括各组织器官，亚细胞及不同发育期的双向电泳图谱。对水稻在各种环境胁迫下以及各种水稻突变体的蛋白质组学研究也是一项重要的研究内容，在这种情况下建立的参考图也将非常有意义，因其直接改善水稻的品质和产量的相关性。目前水稻蛋白质组学主要集中环境因子影响下的基因组表达变化，完整的水稻蛋白组学还要深入研究蛋白质翻译后修饰  (PTMs)，以及蛋白质之间相互作用复杂的网络关系，这是蛋白质组学研究的一项艰巨任务。
      　水稻有关的各种序列信息库日益丰富，如基因序列，表达序列标签 (EST)  等，对于深入研究其生理活动、遗传机制都大有裨益。随着各种数据库的不断充实，生物信息学本身的发展，以及质谱等高通量支撑技术的改进，将会开展大规模的水稻功能基因组研究。总之水稻蛋白质数据库和与其基因组数据库的整合，将有助于我们整体理解作为重要农作物的水稻，同时水稻的蛋白质组学研究也为其他禾谷类农作物的功能基因组研究打下坚实的基础。