Vc银翘解毒片是常用的中成药，由金银花、连翘、甘草等
中药组成，具有辛凉解表、清热解毒的功能。咖啡酸(chlorogenic acid)和绿原酸(caffeic acid)为其主要有效成分。绿原酸具有抗茵、利胆、止血等药理作用，咖啡酸为绿原酸的水解产物。它们分子结构相似，常同时存在于同一药材或同一中药
制剂中，在进行含量分析时常难以分离。有关它们的分离测定对于药物生产具有重要的实际意义。文献报道对其测定有多种方法，如分光光度法、高效液相色谱法等，这些方法存在操作手续麻烦或检测灵敏度低的缺点．而且同时检测绿原酸、咖啡酸和Vc含量尚未见报道。
毛细管电泳(CE)作为一种分离方法以其高效、快速．进样量少等优点得到了日益广泛的重视和应用。我们采用高效毛细管电泳一电化学检测法，以碳圆盘电极为工作电极，通过优化实验参数，对同时测定Vc银翘解毒片中的绿原酸、咖啡酸和Vc的方法进行了研究，结果表明该方法简便、可靠、灵敏，样品用量少，可用于直接检测，适合于常规分析。
1 实验部分
1．1 仪器和试剂
自组装毛细管电泳一柱端射壁安培法电化学检测系统，包括O～30kv无级可调高压电源(上海原子核研究所)，石英毛细管(60cmX25μm，美国PolymicroTech．Co．)，三维定位调节器，三电极电化学检测系统(300μm碳电极，铂对电极，饱和甘汞参比电极)。LC一3D型微电流检测器(美国BAS公司)．台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂)。
绿原酸、咖啡酸购自Sigma公司(St，Louis，MO，USA)，Vc标样从华美生物工程公司上海分公司购得，其他试剂均为分析纯。Vc银翘片购白药店，实验用水为二次蒸馏水。
1．2 实验方法
1．2．1 实验中采用柱端射壁(wall-jet)电化学检测系统，通过三维定位调节器使工作电极与毛细管
出口端在一条直线上，并尽可能靠近毛细管末端．采用电动进样，条件为在20kv下从毛细管阳极端进样6s。缓冲液：20mmol／L磷酸二氢钠+20mmol／L硼砂，pH 为8.5。
1．2．2 标准储备液的配制
精确称取绿原酸、咖啡酸、维生素C标样适量，以体积分数为25％ 的乙醇分别配制1×0.01mol／L的绿原酸、咖啡酸、维生素C标准储备液。绿原酸和维生素C标准储备液置于棕色瓶中，在阴凉避光处存放，并在配制后尽早使用。
2 结果与讨论
2．1 电泳条件的选择
2．1．1 绿原酸、咖啡酸、维生素C的电化学行为
工作电极电位直接影响本方法的灵敏度和检测下限．Vc的响应电流在电极电位达到0.6V(vs．SCE)以后出现一个平台；而绿原酸和咖啡酸的响应电流在0.6V(vs．SCE)以后快速上升，当电极电位超过+O.90V(vs．SCE)时，三者的响应电流上升缓慢，而噪音和基底电流大幅上升，电极的稳定性变差，基线不稳，信噪比反而有所降低，综合考虑选择最佳检测电极电位为+0.90V(vs．SCE)，此时本底电流和检测下限较低，检测电极的稳定性较好。
2．1．2 运行缓冲液酸度和浓度的影响
运行缓冲液的酸度直接影响毛细管内壁的 电位和电渗流(E0F)以及被测组分的荷电情况，从而影响被测组分的迁移时间和分离，因此研究酸度对电泳的影响是优化测定条件的关键。考查了酸度与分离时间及分离度的关系，最终选择pH 为8.5。运行缓冲液的浓度也影响被测物的分离度与迁移时间，还影响峰电流。当pH为8.5时，随缓冲液浓度升高，被测组分的迁移时间和分离度增加，同时电泳峰高降低且噪音增加，使得信噪比降低。综合考虑峰电流、分离度、分离时间和缓冲容量，选择20mmol／L Na4B4O7-20mmol／L NaH2PO4(pH 为8.5)为运行缓冲液。
2．1．3 分离电压和进样时间的选择
选择分离电压时要综合考虑分离效果和迁移时间两方面的因素。分离电压越高，样品的迁移时间越短，但分离效果不如电压较低时好，而且对工作电极的干扰增大。分离电压太低，样品的迁移时间过长，峰形也会有所展宽。本实验选用2okV作为进样及分离电压，在保证分离度的条件下，能在较短的时间内获得最佳的分离效果。
本实验采用电动进样，选择进样电压为2okV。考察了进样时间对峰电流和峰形的影响，确定最佳进样时间为6s。
综上所述，测定绿原酸、咖啡酸和Vc的最佳条件为：以20mmol／L Na4B4O7-20mmol／L NaH2PO4(pH为8.5)为运行缓冲液，分离电压为20kv，进样电压与进样时间分别为20kv与6s，采用碳电极为工作电极，在氧化电位为900mV(vs．SCE)下进行检测，可以快速有效地对三种物质进行分离并测定，得到了令人满意的实验结果。
在优化条件下测得的绿原酸、咖啡酸、维生素C混合标准溶液的电泳图谱。
2．2 重现性、线性及检测下限
2．2．1 重现性
在上述优化实验条件下，将5.0×0.0001mol／l的绿原酸、咖啡酸、维生素C混合标准溶液连续进样7次，重现性良好。峰高的相对标准偏差(RSD)分别为3.4%、3.8%和4.1%．迁移时间的RSD分别为1.2%、2.0%和1.5%．
2．2．2 回归方程、线性范围及检测下限
配制一系列不同浓度绿原酸、咖啡酸和维生素C的混合标准溶液．在最佳条件下测定。绿原酸、咖啡酸和维生素C浓度与峰电流分别在1.0×0.00001 ～5.0×0.01mol／1．1.0×0.0001～5.0×0.001mol／1．1.0×0.00001～ 1.0×0.01mol／l范围内呈良好线性．以噪音电流3倍值对应浓度确定检测下限分别为5×0.00001mol／1.5×0.00001mol／l和6×0.00001mol／1．
2．3 样品测定及回收率实验
将Vc银翘片研成细粉，精确称量(至0.1mg)3份，各约0.5g。每份分3次提取，分别加入25％(体积分数)乙醇10、5、3ml，每次超声振荡30min，静置至室温，经0.22μm 聚丙烯滤膜过滤，合并滤液，移人25ml容量瓶中定容，用运行缓冲液稀释进样。在最佳分离检测条件下按照实验部分操作测定Vc银翘片中绿原酸、咖啡酸和维生素C含量。
[参考文献]
[1] Ramos R，Andrade P B，Seabra R M，et a1．A preliminary study of non—coloured phenollcs in wines of varietal white grapes(codega．Gouvein and malvasia fina)：effects of grape variety，grape maturation and technology of winemaking[J]．Food Chem．1999．67(1)：39～41．
[2] 赵永成．高效液相色谱法测定杜仲叶中的绿原酸[J]．色谱，2000，18(3)：263．
作者：
佚名 2007-5-18