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摘要：通过单因素试验研究了夹带剂比例、温度、时间、压力对超临界C02萃取毛白杨雄花序黄酮类化合物的影响，利用正交试验得到最佳工艺条件：温度60℃，液料比1.5 mL：1 g、压力35Mpa条件下，萃取90min，得率可达0.59％ 。
关键词：毛白杨，雄花序，总黄酮，超临界CO2萃取
毛白杨(Populus tomentosa Carr．)系杨柳科杨属植物，主要分布于辽宁、华北、西北、华东等地，资源极为丰富。在《重修政和经史证类备用本草》以及《本草纲目》中记载着毛白杨树皮煎汤止痢。毛白杨雄花序又称杨枸花，主要活性成分是黄酮类化合物，具有抑菌、消炎、抗病毒等功效，被收载于1977年中国药典。民间常用其水煎剂治疗急性肠炎、细菌性痢疾等，此外其对皮肤瘙痒及荨麻疹等症也有较好的效果。目前，毛白杨除做木材使用外，其雄花序一直未被充分利用，造成资源浪费。本文通过用超临界CO2萃取毛白杨雄花序中的黄酮、类化合物的工艺研究，确定了萃取温度、萃取压力、夹带剂用量以及萃取时间等最佳参数，以期能为毛白杨雄花序进一步开发利用提供参考。
1 仪器与材料
1．1 仪器与设备
Speed 超临界萃取仪(Applied Separations，Inc．)，722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，METTLER-Toledo电子天平。
1．2 材料与试剂
1．2．1 材料
毛白杨雄花序，于2003年3月采自济南市植物园。
1．2．2 主要试剂
芦丁(Sigma公司)，体积分数95％乙醇、硝酸铝、NaN02、NaOH等均为分析纯。
2 试验方法
2．1 标准曲线的制备
精密称取恒重的芦丁标准品20.99mg，置100mL容量瓶中，加体积分数70％乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。准确吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0mL，分别置于25mL量瓶中，依次加体积分数70％乙醇5mL、质量分数5％ NaNo2溶液1mL，摇匀。放置6min，加质量分数10％ A1(NO3)3溶液1mL，摇匀。放置6 min后，加1 mol／L NaOH溶液10mL，再加体积分数70％乙醇至刻度，摇匀。放置15min。在510nm的波长处测定吸光度A，其结果用最小二乘法作线形回归，得芦丁浓度(C，mg／100mL)与A的关系为：A =0.104C 一0.0077 R的平方=0.999。
2．2 提取方法
2．2．1 提取工艺
毛白杨雄花序一千燥一粉碎一称量一超临界萃取
2．2．2 操作要点
(1)新采集的样品经过烘箱60℃ 干燥3h后，粉碎，过20目筛。
(2)称取毛白杨雄花序10.0min，装入萃取釜，并向其中注入夹带剂(体积分数95％乙醇)。将萃取釜放入超临界设备中。调节温度、压力，向泵中充填二氧化碳流体后，开动超临界设备，在出口处用装有体积分数95％乙醇的试剂瓶收集萃出物。
2．3 总黄酮得率的测定
将萃取物定容，按2．1方法测出吸光度A，并计算出黄酮得率C(％)。
3 结果与讨论
3．1 单因素试验
3．1．1 液料比对萃取的影响
超临界CO2是一种非极性溶剂，因此限制了对极性较强的物质(如黄酮类化合物)的应用，为了解决这一问题，通常于超临界CO2中加入适宜的夹带剂，以调节溶剂的极性，提高溶剂的溶解能力。常用的夹带剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙醇-水等，对于极性较强的黄酮类化合物，通常用乙醇或甲醇做为夹带剂。本试验采用体积分数95％乙醇为夹带剂，萃取得率随着夹带剂的增加而增加，但当液料比超过1g：1.25mL，得率增加的幅度比较小。这是由于一方面乙醇在超临界提取黄酮类化合物起到了提携作用；另一方面过多的乙醇会使超临界流体CO2饱和，至使萃取效果不会随乙醇量的增加而明显改善，因此研究确定最佳液料比为1g：1.25mL。
3．1．2 温度对萃取的影响
萃取温度是影响萃取得率的因素之一。夹带剂、压力和萃取时间一定时，萃取得率在温度30～50℃范围内随温度的升高而增加，但超过50℃时，萃取得率反而下降。这是由于温度升高，分子运动速度加快，相互碰撞的几率增加，缔和机会增加，另外温度增加有利于溶质挥发性的增加和提高物料的扩散系数，有利于毛白杨雄花序黄酮类化合物的萃出，但另一方面温度升高又降低了CO2的密度而导致溶解能力下降，对萃取不利。根据图中结果，萃取温度在40～60℃较为合适。
3．1．3 压力对萃取的影响
在超临界萃取过程中，萃取压力也是影响萃取得率的重要因素，它对超临界流体的相对体积质量、粘度和扩散系数的影响较大。试验结果表明：当压力<20MPa时，CO2的单位体积质量比较小，相应其溶解能力也比较小，所以超临界流体对杨序黄酮的萃取率很低；压力在20～25MPa范围内，随着压力的升高，流体单位体积质量显著增加，其对黄酮的溶解也相应增加l6，黄酮萃取得率也随着上升；当压力>25MPa，萃取得率随压力的升高变化不明显，而其生产成本则明显提高。因此，最佳的萃取压力范围应选择在25～35MPa。
3．1．4 萃取时间的影响
萃取时间的增加，有利于超临界流体与溶质毛白杨雄花序中的黄酮类化合物的溶解平衡，增加萃取时间就增加萃取得率。一般情况下，如果萃取时间太短，超临界流体CO2与溶质未达到良好接触，萃取量较少；萃取一定时间后，超临界流体与黄酮类化合物逐渐接近溶解平衡；再增加萃取时间，萃取得率增加有限。随着时间的延长，超临界萃取的能耗也在增加。综合试验结果，最佳萃取时间范围应选择在80～120min。
3．2 正交试验
3．2．1 正交试验设计
根据单因素试验结果，选择影响毛白杨雄花序黄酮提取效果的各主要因素做正交试验，并对结果进行极差分析，确定最佳的提取条件。采用Lq(3的4次方)正交表，以温度、时间、压力、液料比为4因素，选取3个水平进行试验。
3．2．2 正交试验结果分析
用极差分析法分析的试验结果列于表。从表中可知：R3>R1>R2>R4，所以A、B、C、D 4因素对黄酮萃取得影响的主次顺序是C>A>B>D，最佳提取条件为A3B2C3D3即在温度60℃ ，压力35MPa，液料比为1.5mL：1g的条件下，提取90min时，毛白杨雄花序黄酮类化合物得率最高。
3．3 最佳工艺条件试验
按A3B2D3即在温度60℃，液料比1.5mL：1g、压力35MPa，萃取90min的条件下进行3次平行试验。
由表可知：A3B2C3D3条件下黄酮提取率确实高于表中每一项试验结果，在本试验的范围内，A3B2C3D3为最佳的工艺选择。
4 结 论
(1)最佳萃取工艺条件为：萃取压力35MPa，液料比1.5mL：1g，萃取温度60℃，萃取时间90min。
(2)影响黄酮萃取得率的各因素的强烈程度顺序是：液料比>萃取温度>萃取时间>萃取压力。
参 考 文 献
1 何方奕．杨树花挥发性成分的GC／MS分析[J]．辽宁大学学报，2000，27(3)：233～235
2 薛玉梅．分光光度法测定普乐安片中总黄酮含量的测定[J]．现代中药研究与实践，2002，16(6)：13～14
来源：东方医药网