摘要：基于毛细管电泳三脉冲安培检测技术，同时测定了氨基酸注射液中具有电活性的色氨酸和酪氨酸的含量。研究了三脉冲电位及时间、电解液的浓度、酸度、电泳电压及进样时间对电泳分离和检测的影响，得到了最优测定条件。以铂微盘电极为工作电极，Ag／AgC1为参比电极，三脉冲电位为：El-900 mV，tl 100 ms；E2700 mV，t2 100ms；E3 950mV，t3 100ms，在15mmol／L的磷酸盐(pH=11)缓冲溶液中，上述两组分在10min内完全分离。测定色氨酸和酪氨酸的线性范围分别为1×0.001～5×0.0000001 mol／L和1×0.001～ 8×0.0000001 mol／L ，检出限分别为0.25μmol／L和0.17μmol／L(S／N=3)；平行进样的峰电流相对标准偏差(RSD)分别为2.9%和3.3% (n=7)。
关键词：毛细管电泳；脉冲安培检测；色氨酸；酪氨酸
氨基酸是蛋白质的基本组成单位，而蛋白质是生命的物质基础，因此氨基酸在生命过程中起着重要的作用，对其分析测试也受到人们的重视。目前，分离测定氨基酸的方法主要有柱后衍生、光度检测的阳离子交换色谱法，柱前衍生、光度检测的反相高效液相色谱法，上述方法需要对其进行衍生化处理，容易使样品受到污染。毛细管电泳电化学检测已经用于氨基酸的分离分析，它具有高效、快速、灵敏、低廉等优点，但是氨基酸氧化产物容易在电极上发生吸附，导致电极毒化，重现性降低，特别是铂、金电极非常容易钝化，因而解决电极钝化问题是人们努力的目标。使用三脉冲安培检测，选择合适的电极电位对电极表面进行处理，可以使电极表面不断更新，消除了电极的钝化问题，以铂、金电极为工作电极，使用三脉冲已经成功地对糖类进行了检测。本文以铂微盘电极为工作电极，建立了一种毛细管电泳三脉冲安培检测测定注射液中色氨酸和酪氨酸的新方法。
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
毛细管电泳电化学检测系统为自行组装，包括0～±3O kV 可调高压电源(上海原子核研究所)，65cm×25μm i．d．石英毛细管(河北永年光导纤维厂)，CHI812电化学分析仪(上海辰华仪器公司)，三维定位调节器(自行改制)；三电极体系：铂微盘电极(φ=125μm)为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag／AgC1电极为参比电极。
色氨酸，酪氨酸均为层析纯(上海康达氨基酸厂)，它们的标准溶液用三次蒸馏水配制成0.01mol／L储备液于冰箱中保存，其他所用试剂均为国产分析纯。复方氨基酸注射液(18AA)(宜昌三峡药业有限责任公司)。
1．2 实验方法
1．2．1 工作电极的制作与处理 将玻璃管在酒精喷灯上拉细至内径约200μm，截取其中一段，将一端焊有铜线的铂丝插入其中，并伸出尖端5mm，在酒精喷灯上加热尖端至熔融，从而将铂丝密封在玻璃管内，玻璃管开口端用环氧树脂密封，室温固化待用。使用前，用
手术刀将伸出尖端的铂丝沿玻璃管
出口垂直截取，在金相砂纸上粗研和细磨后，再用粒径0.2μm 的氧化铝粉末在乎板玻璃上进行抛光，然后于蒸馏水中超声洗涤待用。
1．2．2 电泳分离和检测 毛细管分别用0.1mol／L NaOH 溶液和蒸馏水各洗涤5min，然后用15mmol／L磷酸盐缓冲溶液洗涤30min，同时开启电化学检测器，设置检测电位为0.95V(vs．Ag／AgC1)，待整个系统稳定后，电动进样一定时间，在25kV的分离电压下进行电泳分离，并记录电泳图谱。
2 结果与讨论
2．1 色氨酸、酪氨酸在铂电极上的电化学行为
色氨酸、酪氨酸在铂电极上有较高的响应，但连续的吸附会造成产物在电极上积累而毒化电极。分别为色氨酸、酪氨酸在微铂电极上的循环伏安图，1、2、10分别为循环扫描第一圈、第二圈和第十圈的伏安图。扫描第一圈时，色氨酸、酪氨酸都在微铂电极上得到了较大的氧化电流，但第二圈时氧化电流明显变小，且随扫描次数的增多，氧化电流还要减小，主要是由于金属铂存在未饱和的d轨道，而氨基酸的氧化产物含有孤电子对，很容易在微铂电极上吸附沉积，使电极钝化。因此，要对这两种物质进行连续检测必须对电极进行周期处理，本实验选择了三脉冲安培检测。
2．2 三脉冲电位和时间的选择
采用三脉冲进行检测时，清洗电位(E1)、电极处理电位(E2)和检测电位(E3)的选择十分关键。合适的E1必须能够保证除去氨基酸的氧化吸附产物，同时将PtOH还原成金属铂，使微铂电极表面不断得到更新。通过实验我们选择E1为一O.9V；必须能使电极表面形成PtOH达到活化电极的目的，实验表明，较低的电位不能有效地形成PtOH，较高的电位使PtOH氧化为PtO，从而使电极钝化，所以我们选择E2为0.7V；为了选择检测电位E3，进行了脉冲伏安实验，从可以看出，色氨酸和酪氨酸在0.85V附近具有较大的电流响应，在本实验过程中，由于高压电场使检测电极的电位降低，我们选择表观检测电位为0.95 V。考虑到检测的重现性和灵敏度，必须选择适当三脉冲时间，最后得到优化的三脉冲检测条件为：El一900mV，t1 100 ms；E2 700mV，t2 100ms；E3 950mV，t3 100ms。从优化条件下的酪氨酸和色氨酸重复扫描的脉冲伏安图可见，1～10圈扫描得到的脉冲伏安图重合良好，表明电极表面重现性较好，无钝化现象。
2．3 缓冲溶液种类、pH值及浓度的选择
氨基酸为两性电解质，色氨酸和酪氨酸的等电点分别为5.89和5.66，考虑到在铂电极上进行电化学检测和实现二者的电泳分离，我们选择了碱性电泳介质如NH3-NH4C1、磷酸缓冲溶液等进行了毛细管电泳安培检测实验。从基线噪音、峰形和峰电流综合考虑，发现磷酸盐缓冲溶液最好。
配制了pH值分别为9、9.5、10、10.5、11、11.5、12的磷酸盐缓冲溶液进行实验，结果发现，随着pH值的增加，迁移时间逐渐增加，其原因主要是氨基酸的一NH3+电离度增大，粒子的荷质比随之增加；pH值较小时，氨基酸容易在毛细管壁上吸附造成峰脱尾等影响，本文选择最佳pH值为11。
在最佳pH值下，考察了1O、15、2O mmol／L的磷酸盐缓冲液对电泳的影响，结果表明，随着缓冲溶液浓度的增加，提高了分离度，分析时间也随着增加，同时产生较多的焦耳热，使峰形不好，噪音增加，基线也不稳定，综合考虑各方面的因素，我们选择15mmol／L的磷酸缓冲溶液(pH11)作为最佳电泳介质。
2．4 分离电压和进样时间的选择
选择分离电压时要兼顾分离效果和迁移时间两方面。分离电压越高，各组分的迁移时间越短，但分离效果不佳，而且对工作电极的干扰增大；分离电压太低，样品的迁移时间过长，电泳峰随之展宽，峰高测量误差增大。综合考虑分离度、峰展宽、灵敏度、噪音、焦耳热及分析时间等因素，选择25kV为分离电压。
在确定了电泳介质和分离电压的情况下，我们比较了不同进样时间对峰高的影响，发现最初峰高与进样时间成正比，但进样时间超过6s后峰高增加不明显，而电泳峰展宽，各组分的分离度变差。但进样时间太短则减小了进样重现性，加大了偶然误差，增加了实验操作的难度，降低了灵敏度。综合考虑，我们选择进样时间为6s。
2．5 分析方法的重现性、线性范围及检出限
在上述优化条件下，将4.0×0.00001mol／L的混合标准溶液连续进样7次，重现性良好。色氨酸、酪氨酸峰高的相对标准偏差(RSD)分别为2.9 、3.3 ，迁移时间的RSD分别为1.1 、1.3％ 。
配制一系列不同浓度的色氨酸、酪氨酸的混合标准溶液，在选定的条件下，考察了该方法的线性范围，发现色氨酸、酪氨酸的浓度分别在1×0.001～5×0.0000001mol／L，1×0.001～8×0.0000001mol／L范围内与电泳峰电流呈线性关系，以x表示样品浓度(0.000001mol／L)，y表示峰电流(nA)，线性回归方程分别为y=2.8787x一1.1415，r=0.9965(色氨酸)；y=5.4692x一3.8844，r=0.9962(酪氨酸)；基于三倍信噪比，色氨酸和酪氨酸的检出限分别为0.25μmol／L和0.17μmol／L。
2．6 样品分析及回收率实验
将适量复合氨基酸注射液用缓冲溶液稀释，按前述实验方法测定，得电泳图。测定结果和回收率。
参考文献
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作者：
佚名 2007-5-18