高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制剂的活性

摘要：建立了体外直接测定血管紧张素转化酶抑制剂活性的高效液相色谱分析方法。以马尿酰-组氨酰-亮氨酸为反应底物，血管紧张素转化酶为催化剂，反应所生成的马尿酸为测定指标，未加酶抑制剂的反应为空白对照。使用ZORBAX SB-Cl8色谱柱(4.6mm i．d．×150mm，填料粒径5μm)，柱温25℃，流动相为乙腈-超纯水(体积比为25：75，各含0.05％(体积分数)三氟乙酸及0.1％(体积分数)三乙胺)，流速0.5 mL／min，检测波长228nm。在马尿酸浓度为0.005～1.000mmol／L时，马尿酸浓度与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999)，最小检测限为0.50μmol／L；该方法对马尿酸的回收率为99.48％～105.64％，相对标准偏差(RSD)为2.20％( n=6)。该方法可适用于血管紧张素转化酶抑制剂活性的体外测定，具有操作简便、精密度和准确性高的特点，为降血压药物的研制提供了方便可靠的检测手段。
关键词：高效液相色谱法；血管紧张素转化酶抑制剂；马尿酸
血管紧张素转化酶(angiotensin I-conveningenzyme，简称ACE)主要参与肾素-血管紧张素-醛固酮系统的调节。ACE催化血管紧张素I(angiotensinI)能转变为具强效升高血压作用的物质— — 血管紧张素Ⅱ(angiotensin lI)；同时，ACE将具降压作用的物质—— 舒缓激肽(bradykinin)降解，使之失去降压作用。ACE的这些性质在参与血压调节方面发挥着重要作用。目前用于降血压的药物，其降压原理主要是抑制ACE的活性。面对高血压患者数量的不断增长，越来越多的工作者致力于血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin I—convertingenzym e inhibitor，简称ACEI)的开发研究，而在此过程中实现抑制剂降压效果体外检测的重要途径就是测试其对ACE活性的抑制作用。因此，建立一种快速、简便、准确度高的检测手段是提高降血压制剂研究效率的保证。
目前，对于测定ACEI活性的研究主要采用3种方法：第一种是乙酸乙酯萃取法，这种方法是将反应体系的产物先用乙酸乙酯萃取，然后真空挥发去掉乙酸乙酯，再用蒸馏水溶解后在228nm处紫外扫描。该方法操作步骤多，而且由于反应所生成的马尿酸和组氨酰一亮氨酸均在228nm处有吸收，因而易使结果偏高；第二种是高效毛细管电泳法。第三种是高效液相色谱法(HPLC)。在初期的研究中，HPLC的检测样品是乙酸乙酯萃取物；2002年，Wu等川提出一种改进的直接用HPLC测定血管紧张素转化酶催化反应的方法，但采用的洗脱方式是梯度洗脱。本文以常用的治疗高血压药物— — 卡托普利(Captopn1)作为ACEI，通过多次试验，得出一种直接进样、等度洗脱便能达到良好分析效果的HPLC测定ACEI活性的方法。
1 实验部分
1．1 仪器、试剂与药品
Agilent-1100高效液相色谱系统，配有自动进样器、Agilent-1100液相色谱工作站、二极管阵列检测器(检测波长190～700nm)，购自美国安捷伦公司；生化培养箱、取液器，购自上海金林生化试剂仪器厂；马尿酸(hippuric acid，简称Hip)，购自中国医药集团上海化学试剂公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Ⅳ-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，简称HHL)，购自瑞士Fluka公司；血管紧张素转化酶(取自兔肺，EC3．4．15．1)，购自美国Sigma公司；卡托普利，购自美国Sigma公司；乙腈，HPLC 级；三乙胺、硼
酸、硼砂、氯化钠均为分析纯。
1．2 色谱条件
ZORBAX SB-C18分析用色谱柱(4.5 mm i．d．×150mm，填料粒径为5μm)，柱温25℃，流动相为乙腈-超纯水(体积比为25：75，各含0.05％(体积分数)三氟乙酸及0.1％(体积分数)三乙胺)，流速0.5 mL／min，检测波长228nm，自动进样．进样量5μL。
1．3 样品制备
1．3．1 试剂的配制
Captopnl溶液：按所需配制的浓度，称取适量Captopril样品，用0.1 mol/L硼酸缓冲液(pH 8.3，含0.3 mol/L NaC1)溶解，再用同种缓冲液配成所需浓度的Captopril溶液。
ACE溶液：将1 U ACE溶于l0mL 0.1mot／L硼酸缓冲液(pH 8.3，含0.3mol／L NaC1)中即得。HHL溶液：取HHL适量，以0.1mol／L硼酸缓冲液(pH 8.3，含0.3mol／L NaCl)溶解配成5.5mmol／L HHL溶液。马尿酸标准液的制备：取马尿酸标准品适量，用双蒸水配制不同浓度的马尿酸标准液。
1．3．2 反应液的制备
取不同浓度的Captopril溶液1OμL，加入5μLACE溶液，在37℃下保温5min后加入50μL HHL溶液开始反应，在37℃条件下反应30min后加入85μL 1.0mol／L HC1中止反应，得到反应液。
1．3．3 混合液及空白样品的制备
在反应液中加入不同浓度的马尿酸标准液即得混合液。将该混合液用0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析。同时用10μL pH 8.3的硼酸缓冲液替代Captopril溶液制备反应液，作为空白对照组。
1．4 测定原理
三肽HHL在ACE的催化下快速地分解产生马尿酸和二肽His-Leu(简称HL)。当加入ACEI样品时，ACE的活性受到抑制，马尿酸和二肽的生成量减少，因此可通过HPLC测定马尿酸的生成量来评价ACEI对ACE活性的抑制率。计算公式为：R=A-B/A ×100％ (1)
式(1)中， 为ACEI样品对ACE的抑制率(％ )；A为空白对照组中马尿酸的峰面积(mAU ·S)：B为添加Captopril组中马尿酸的峰面积(mAU ·S)。
2 结果与讨论
2．1 检测波长的确定
用0.1mol／L的磷酸缓冲液(pH 8.3)配制0.5mmol／L的HHL溶液，用双蒸水配制1mmol／L的Hip，然后在190～300 nm 波长处扫描，Hip和HHL的紫外吸收波谱图表明，马尿酸在228nm波长处有最大吸收，HHL在210～250nm波长处有较宽的吸收峰，因此HPLC检测时可以采用228nm作为检测波长。
2．2 色谱分析
在“1．2”节选定的条件下得到的色谱图如图。由图可见，马尿酸、二肽和三肽能达到良好分离，但加Captopril组马尿酸的峰面积比空白组马尿酸的峰面积减小。图还说明马尿酸的出峰时间保持稳定。
2．3 线性关系及检测限
取浓度为1 mmol／L的马尿酸标准液，再用双蒸水分别稀释成0.5，0.1，0.05，0.01，0.005mmol／L系列浓度，经0.45μm 滤膜过滤后进样分析。结果马尿酸峰面积S(mAU ·S)与浓度C(mmol／L)的线性回归方程为：S=1.272 31×10000C+3.59428，r=0.9999，表明马尿酸浓度与峰面积具有良好的线性关系，因而样品中马尿酸的峰面积能够反映样品中马尿酸的含量，进而反映ACEI的抑制活性。
将标准马尿酸溶液进一步稀释发现，当其浓度为0.50μmol／L时，其峰面积与浓度仍符合上述线性方程，而浓度继续降低，则所得的马尿酸峰面积逐步偏离标准曲线。因此，此法测定马尿酸的检测限为0.50μmol／L。
2．4 回收率及精密度试验
取3种不同浓度(见表中的表注)的Captopril反应液，分别在3种浓度的反应液中各自加入两种不同浓度的马尿酸标准液作为混合液。分别测定反应液、混合液、马尿酸标准液中马尿酸的浓度并据此计算回收率，结果表明，不同浓度Captopril所制备的反应液中添加不同浓度的马尿酸标准液时，马尿酸的回收率为99.48％～105.64％，相对标准偏差(RSD)为2.20％(n=6)。将0.02 μmol／L Captopril所制备的反应液中马尿酸的峰面积重复测定5次，其RSD为1.25％，方法的精密度良好。
3 结论
本法中反应液直接进样，只需等度洗脱便可使Hip、HL、HHL达到良好分离，具有简便、快捷、精密度和准确性高的特点，为降血压药物的药效提供了方便可靠的体外检测手段。
参考文献：
[1] Yamamoto N，Akino A，Takano T．Biosci Biotech Biochem，1994，58(4)：776