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摘要 通过优化GC×GC 的柱系统、温度程序和调制参数等色谱条件, 建立了分析中药莪术挥发油组成的全二维气相色谱/飞行时间质谱(GC×GC/TO FM S) 方法, 实现了莪术挥发油的单个组分与族组分分析. 采用所建立的GC×GC/TO FM S 方法, 鉴定出匹配度大于800 的组分有249 种, 其中单萜18 种, 单萜含氧衍生物34 种, 倍半萜35 种, 倍半萜含氧衍生物37 种, 有69 种组分的体积分数大于0.02%.
关键词 挥发油; 莪术; 柱系统; 全二维气相色谱; 飞行时间质谱
气相色谱(GC) 及气-质联用(GC/M S) 是药用挥发油的主要分析手段. 但由于中药挥发油组成复杂, 且含量不均一, 常规GC 与GC/M S 的分离能力较差, 导致峰重叠严重, 低含量组分定性定量分析不准确. 多维色谱可以提高系统的分辨率与灵敏度, 与质谱联用可对组分进行准确的定性分析, 是复杂体系分离分析的有效方法[ 1 ]. 全二维气相色谱[ 2, 3 ]是把分离机理不同而又相互独立的2 根色谱柱以串联方式连接在一起的二维系统, 与GC 相比, 该系统具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量、族分离效应和瓦片效应等优点[ 4～ 7 ]. 目前主要用在石油、环境与植物精油等分析领域[ 8～ 10 ].莪术是我国传统的中药材, 具有活血破淤, 行气止痛之功效. 近年来的研究表明, 其挥发油具有抗肿瘤、抗早孕、抗炎、抗菌和降酶等作用[ 11 ]. 过去采用GC/M S 分析莪术挥发油, 只鉴定出约100 种组分[ 12～ 16 ].本文在优化柱系统、温度程序和调制参数等色谱条件的基础上, 对莪术挥发油的化学成分进行了研究, 得到匹配度大于800 的组分有249 种, 其中69 种组分的体积分数大于0.02%.
1 实验部分
1. 1 仪器与柱系统
GC×GC 系统由A gilen t 6890 气相色谱仪(安捷伦公司) 和冷喷调制器KT 2001 (ZEOX, 美国) 组成, F ID 检测器. 优化选择了2 套柱系统, 第一套柱系统: 柱1 为DB-PETRO (J &W Scien t if ic, 美国)(50 m ×0.2 mm ×0.5um) , 柱2 为DB-17h t (J &W Scien t if ic, 美国) (2.6 m ×0.1mm ×0.1um) ; 第二套柱系统: 柱1 为SOL GELWAX (SGE) (60m ×0.25mm ) , 柱2 为Cyclodex-B (SGE) (3 m ×0.1mm×0.1um).
1. 2 GC×GC 与GC×GC/TOFMS 实验条件
进样口温度250 ℃; 检测器温度260 ℃; 载气为氦气, 恒压操作, 柱前压607 kPa; 第一套柱系统温度程序: 初始温度80 ℃, 以3 ℃/m in 升至170 ℃, 再以2 ℃/m in 升至240 ℃(保持5m in) ; 第二套柱系统温度程序: 初始温度70 ℃(保持3 m in) , 升温速率为3 ℃/m in, 终点温度为200 ℃(保持25 m in). 接口温度230 ℃; 离子源温度240 ℃; 质量扫描范围35～ 400 u; 第一套柱系统调制周期为4 s; 第二套柱系统调制周期为6 s; 冷气流速20mL/m in, 热气加热电压为60V; 谱图由T ran sfo rm 和Zoex 软件生成、处理和定量.
1. 3 样品来源
莪术购自大连美罗大药房, 按照中华人民共和国药典[ 17 ]一部附录XD 提取挥发油.
2 结果与讨论
2. 1 色谱方法的建立
GC×GC 分离机理与GC 类似[ 18 ] , 影响分离的因素有温度、线速、载气的种类和柱系统等. 除此之外, 调制参数的设置与不同柱系统的匹配也影响GC×GC 的分离. 柱系统的匹配包括柱长、内径和液膜厚度与固定相的匹配. 实验所用调制器为冷喷调制器, 调制参数包括冷气与热气的设置和调制周期的选择.
2. 1. 1 调制参数的优化 将液氮作为冷喷调制器的气源(热气与冷气) , 冷气和热气分别起吸附和脱附作用. 冷气流量与热气加热电压是可调的, 因此冷气流量和热气加热电压的设置会影响调制效果.固定合适的冷气流量, 变化加热电压, 可得峰高与峰面积的比值与加热电压的关系(图1).由图1 可见, 电压在30～ 60 V 之间时, 随加热电压的增加, 聚焦效果明显改善; 而电压超过60 V时, 聚焦效果改善不明显, 因此, 加热电压选为60V. GC×GC 要求从柱1 流出的组分被调制3 次或4次, 同时要求下一周期的组分与上一周期不相重叠[ 8, 19 ] , 通过研究得到适合莪术挥发油的调制周期为4～ 6 s.
2. 1. 2 温度程序的选择 在GC×GC 中, 组分在柱2 中的保留时间只有几秒, 可以认为是在恒温下进行的, 因此柱1 的流出温度决定了柱2 的保留时间. GC×GC 调制要求柱1 产生一个比柱2 相对较宽的峰, 因此升温速率不能太快, 否则会降低柱1 的分辨率. 针对中药挥发油, 选择升温速率为2～ 3 ℃/m in.
2. 1. 3 柱系统的选择 迄今, 文献报道的二维柱系统均为第一维使用厚液膜或者较长的非极性柱,第二维使用细内径、薄液膜、中等极性或极性的短柱[ 7, 10, 20 ]. 第一维按照沸点分离, 第二维按照极性分离, 结合程序升温, 可以实现正交分离.图2 (A ) 给出了采用此柱系统对莪术挥发油的分离结果, 各组分在二维平面上主要按族加以分离.采用此柱系统虽然实现了族组分分离, 但组分间的重叠严重. 定性研究表明, 这些严重重叠的组分以中等极性或者极性物质为主, 并且有许多组分是同分异构体. 为此, 我们将第一维用极性柱代替非极性柱, 第二维用手性柱代替中等极性柱. 实验结果表明, 组分按照极性与分子构型的不同较好地分布于二维空间[见图2 (B) ], 实现了单个组分间的分离.
2. 2 GC×GC/TOFMS 定性结果
在GC×GC 中, 调制周期一般在4～ 10 s, 而第一维色谱峰的峰宽一般在0.1～ 0.5m in, 因此, 1 个峰被多次调制进入检测器, 被TO FM S 多次鉴定和确认. 图3 为1 个组分被多次鉴定的实例. 樟脑被调制3 次, 鉴定了3 次, 匹配度分别为933, 917 和931. 每1 个被鉴定的组分均给出了多种定性信息, 包括相似度与反相似度信息, 这使GC×GC/TO FM S 在鉴定组分数量以及可靠性方面远远优于GC/M S 方法.GC×GC/T O FM S 对图2 (A ) 的定性结果: a 区中主要物质为单萜, b 区中主要物质为单萜含氧衍生物, c 区中主要物质是倍半萜, d 区中主要物质是倍半萜含氧衍生物. 根据族分离规律, 不必用TO FM S 就可对类似的样品实现族组分定性. 对于质谱匹配度比较低的组分, 也可以根据此组分在二维平面所处的位置辅助定性.图2 (B) 中, GC×GC/TO FM S 鉴定出匹配度大于800 的组分有249 种, 匹配度大于850 的组分有163 种, 匹配度大于900 的组分有80 种. 在这249 种组分中, 有醇和酚类84 种, 烃类80 种, 酮类25 种,醛类11 种, 醚类14 种, 酸和酯类11 种, 其它类24 种. 这些组分中, 有18 种单萜, 34 种单萜含氧衍生物, 35 种倍半萜和37 种倍半萜含氧衍生物. 表1 列出了体积分数大于0102% 的69 组分, 这69 种组分总体积分数为90171%.
3 结 论
无论是中药的药理研究还是质量控制, 首先要弄清化学物质基础. 传统的一维色谱由于峰容量不足、灵敏度与分辨率较低, 导致峰重叠严重, 分离不理想. GC×GC 具有高灵敏度、高分辨率、族分离效应等优点, 是复杂体系分离分析的有效方法. 本文在优化的条件下, 对广西莪术挥发油进行了定性分析, 鉴定出的组分远远多于文献上报道的组分.
来源：东方医药网