摘要：利用毛细管区带电泳法对新型HIV 抑
制剂(β-咔啉类药物)、HIV Tat蛋白与HIV TAR RNA竞争作用中的反应物和产物进行分离，研究了这种新型HIV抑制剂与RNA的相互作用，证明了其结合比为1：1，并进一步测定了该反应的结合常数为2.76×10000L／mol，与Tat蛋白和RNA的结合常数相近，说明这种抑制剂可与蛋白竞争性地结合RNA，从而有效抑制病毒复制。此结果与生物学方法的结论一致。
关键词：毛细管电泳，人类免疫缺陷病毒抑制剂，反式转录激活子蛋白，核酸，结合常数
1 引 言
毛细管电泳在
临床分析和药物检测等领域具有广泛的应用前景，在研究生物大分子和小分子相互作用方面具有其独特的优势。
艾滋病由人类免疫缺陷病毒(HIV)所引起。研制有效的HIV抑制剂是当务之急，而HIV的快速变异和
遗传异质性使目前临床上应用的两类抗艾滋病药物(逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)极易产生耐药性。为了解决这个棘手的问题，基于近期所阐明的HIV基因表达调控的分子生物学机制，选择了HIV Tat(trans-activirtor of transcription)蛋白与HIV TAR(trans-activirtor response region)
RNA的结合激活病毒转录这样一个关键环节 ，以HIV TAR RNA为新的靶标，设计新型HIV抑制剂(β-咔啉类药物M)，它可以与HIV-1 Tat竞争，与TAR RNA的特异部位结合，从而抑制转录的激活使转录不能进行，而阻止病毒复制。为了研究抑制剂的靶向作用特异性，即药物M是否与TAR RNA结合以及它与转录反式激活子的竞争反应程度，我们建立了一种方法，利用毛细管区带电泳对β-咔啉类药物M、HIV-1 Tat和TAR RNA的竞争作用中的反应物和生成物进行分离，分别测定药物M、HIV-1 Tat和TAR RNA结合常数，比较两个反应的结合常数，就可以了解M与Tat Peptide的竞争作用。通过测定一系列药物与TAR RNA的竞争作用，就可以对这一系列药物进行药效的初步评价和筛选。
2 实验部分
2．1 试剂与仪器
β-咔啉类药物M(MW：324)(北京大学医学部天然药物和仿生药物国家重点实验室)，Tat蛋白模型序列(MW：2297)和TAR RNA模型序列(MW：9188．4)(德国Sigma公司)，其它试剂均为市售分析纯试剂。CE-212型毛细管电泳仪(北京大学Micro Analytical公司)，λ214 nm，数据由康志色谱工作站收集处理。毛细管(河北永年光导纤维厂)55 cm×75μm i．d．，有效分离长度47cm，毛细管温度约25℃。
2．2 分离条件
缓冲液：50mmol／L NaH2PO4-Na2HPO4(pH=8.0)，使用前经0.45μm的微孔滤膜过滤。药物、蛋白和RNA的溶液均由中性磷酸缓冲溶液(PBS，pH=7.4，C=10mmol／L，除菌)配制。运行电压：12kV，进样时间：10s。每次运行前，毛细管先用0.2 mol／L的NaOH冲洗5min，再用去离子水冲洗2min，随后用缓冲溶液冲洗3min，然后进样。每份样品均平行分析3次。
3 结果与讨论
3．1 分离条件的优化
3．1．1 缓冲溶液pH值对分离的影响 考虑到研究目标是测定药物在生理条件下(pH 6.0～8.0)与蛋白的竞争作用，所以考察了在这个范围内最佳的分离条件。pH分别为5.8、6.8、7.4和8.0分离了药物和蛋白。结果显示，随着缓冲溶液pH值的增大，被迁移物的迁移时间缩短。当pH值升高时，电渗流显著增加，被迁移物的迁移速度加快，迁移时间缩短；另一方面，缓冲溶液的酸度降低，药物和蛋白表面所带的正电荷数目减少，被迁移物的迁移速度变慢，迁移时间延长。从结果看，电渗流对迁移速度的影响大于对电荷的影响。本实验选择8.0为最佳pH值。
3．1．2 缓冲溶液的浓度对分离的影响 增大浓度可使溶液离子强度增大，从而改善分离效果。本实验由于分离的样品纯度大约为99％。考察了不同浓度缓冲溶液对药物和其杂质分离的影响，发现在缓冲溶液浓度为50mmol／L时，其可以达到基线分离。
3．2 药物、蛋白与RNA的作用
Tat蛋白具有86个氨基酸的多肽，所合成的模型序列为：丝氨酸-酪氨酸-苷氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-苷氨酸。
由于蛋白与RNA的特异作用，药物是以蛋白为模板来设计的。理论上，药物与RNA的相互作用情况应和蛋白与RNA的相互作用情况相似，并能与蛋白相竞争以达到抑制转录的激活。与游离时的峰面积相比，药物、蛋白与RNA混合后各自的峰面积均明显减小，说明和蛋白与RNA的结合类似，药物与RNA也发生了结合作用。
3．3 定量分析
由以上定性与定量的结果可以看出，药物和蛋白与RNA均为1：1结合，且结合常数相近。说明药物与RNA的结合作用和蛋白与RNA的结合作用类似，药物可与蛋白竞争性地结合RNA，从而使蛋白被置换下来，有效地抑制了转录的激活，达到了阻止病毒复制的目的。如果能研制出一系列类似的药物，可更好地进行药效的评价和筛选。
References
1 Lin Jinming(林金明)，Chen Zilin(陈子林)．Acta Pharmaceutica Sinica(
药学学报)，1999，34(9)：716～720
作者：
爱屋及乌 2007-5-18