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摘要:以肠道病毒71 型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法。该方法以高效液相色谱(HPLC) 为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离。利用ProteoVue 软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue 软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白。二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2 个pH 为一个收集区段,在pH8.5～3.9 的范围内可见蛋白条带约1 200 条。该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路。
关键词:蛋白质组; 二维液相色谱分离; 肠道病毒71 型; 宿主细胞
1994 年澳大利亚学者提出了Proteome-蛋白质组这个新术语,标志着Proteomics-蛋白质组学这一新学科的产生。蛋白质组学为揭示疾病机理、寻找新的检测指标蛋白和治疗靶点提供了有力的工具。
目前蛋白质组的研究工作主要分两个方面,一是通过二维凝胶电泳等技术得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱,建立参考图谱和数据库;另一方面是进行不同条件下的蛋白质组差异比较分析。目前蛋白质组学的发展既受技术的推动也受技术水平的限制,传统的固相-D 技术(一维根据等电聚焦分离,二维根据分子量大小进行分离) 仍是目前蛋白质组分离的主流技术,但因其重现性较差、灵敏度低和耗时等缺点[1 ] ,有逐渐被新技术补充和取代的趋势。本研究利用二维液相色谱仪建立了一种将病毒感染细胞蛋白质组按等电点和疏水性进行二维液相色谱分离和比较的方法。
材料与方法
1 仪器和试剂 二维液相色谱仪: ProteomeLabTM PF-2D 目标蛋白快速分离系统和配套试剂盒为Beckman Coulter 公司产品。
2 细胞培养、病毒感染 非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞) 由北京金迪克生物技术研究所提供。肠道病毒71 型毒株来源于我国深圳地区临床粪便标本,从标本中分离病毒并使之在Vero 细胞中传代,保存毒种并进行了TCID50测定。设感染组和对照组两组。病毒接种前,Vero 细胞培养于含10 %胎牛血清的1640 培养基(Hyclone 公司) 中,待细胞生长至单层,对病毒原液进行100 倍稀释接种细胞。接种后,两组细胞均换为在含2 %胎牛血清的1640 培养基中维持生长。其他培养条件为37 ℃、5 % CO2 、饱和湿度培养箱内培养。4 天后病变程度达8 时收集细胞制备样品。
3 样品制备 胰酶消化细胞,对照组和感染组均收集约2×10 7 个细胞,预冷的PBS 洗后用2ml 50 mmol/ L 的Tris 溶液(pH 值为7.8～8.2) 重悬细胞,加入8ml 的细胞裂解液:7.5mol/L 尿素, 2.5 mol/ L 硫脲, 12.5 % 甘油, 50mmol/ LTris 溶液(pH 值为7.8～8.2) ,2.5 %辛-β-D-吡喃葡萄糖苷,6.25 mmol/ L TCEP ,1.25mmol/ L 的蛋白酶抑制剂混合物,充分振荡后,4 ℃32 000r/ min 离心60min。取上清液2.5ml在已用25ml 起始缓冲液(SB) 平衡过的PD-10 柱脱盐,再以SB 进行洗脱并收集前3.5ml 。BCA 法测定蛋白浓度。
4 一维色谱聚焦分析
4.1 色谱条件 HPCF 1D 色谱柱,流动相为SB、EB (用50mg/ ml 的饱和亚氨基二乙酸溶液或1mol/ L 的NH4OH 分别调节pH 为8.5 ±0.1 和4.0 ±0.1) ; 1mol/ L NaCl 和水。试验前将各溶液脱气5min ,设定流速为0.2ml/ min ,检测波长为280nm ,室温运行。系统pH 计在线监测流动相的pH ,每次运行前用pH 标准液(pH4.0 、7.0 、10.01) 依次校正该系统pH 计。
4.2 分析程序 整个程序运行由32Karat 软件(二维液相色谱仪自带) 控制自动进行,先以30 倍柱体积的SB 平衡柱子(约运行130min) ,然后将蛋白样品2ml 进样,用SB 洗脱20min ,再用EB 洗脱55min ,pH 值开始下降时,每间隔0.2个pH 单元收集1 份样品,共收集样品23 份。当流出液的pH 为4.0 ±0.1 时,用10 倍柱体积的1 mol/ L NaCl 和水依次洗脱。收集的样品可立即进行试验或保存于- 80 ℃的冰箱内待用。
5 二维反相色谱分析
5.1 色谱条件 HPRP 2D 色谱柱,流动相A 为0.10 %TFA水溶液,流动相B 为0.08 % TFA 乙腈溶液,试验前脱气5min ,设定流速为0.75ml/ min ,检测波长为214nm ,50 ℃恒温运行。
5.2 二维分离和重现性分析 用10 倍柱体积的流动相A平衡柱子,然后对一维分离后收集的样品按线性洗脱梯度进行洗脱,洗脱梯度为0～100 %B ,30min。ProteoVue 软件(二维液相色谱仪自带) 自动保存每份样品的色谱数据并可将其转换成模拟胶图。对3 批样品同一p I 组份重复分析3 次,计算tR(保留时间) 和峰面积的RSD(标准偏差) 值。
6 病毒感染前后细胞蛋白质组数据分析比较 DeltaVue 软件(二维液相色谱仪自带) 可将感染前后Vero 细胞蛋白质组的数据进行比较,并可将差异峰以条带的直观图像形式显示。
讨 论
蛋白质组学作为一门新兴学科,其发展相对于技术的依赖性是有目共睹的。传统的固相2D 技术仍然是目前复杂蛋白组份分离的主流技术,但其分离能力有一定限度,重复性差,上样量小,难以检测到低丰度和难溶于水的蛋白。而往往这些蛋白对生理和病理过程具有关键性的调节作用。目前以高效液相色谱方法(HPLC) 为主的技术平台,特别是与各种质谱串联的多维色谱分离技术逐渐克服了传统固相2D 技术存在的缺陷,因此传统固相2D 技术有逐渐被新技术补充和取代的趋势。二维液相色谱分离法包括液相状态下的色谱聚焦(第一维) 及无孔硅胶反相HPLC 分离(第二维) 。从第二维洗脱的蛋白质可用电喷雾离子阱质谱( ESI2MS) 直接检测,或用基质辅助激光解吸质谱(MALDI2MS) 测定分离蛋白的完整分子量。该方法具有以下几个优点: (1)上样量大,灵敏度高,有利于低丰度蛋白质的检测;(2) 容易自动化,可直接与质谱联用。二维液相色谱分离法可提供溶液状态下的纯蛋白,因此可以使用ESI-MS 或MALDI-2MS 分析获得高精确的完整蛋白质的分子量; (3) 分辨率高,无孔硅胶柱的无孔键合相有利于蛋白质的快速、高分辨的分离,因此可更快捷地获得更精细的蛋白质表达谱信息; (4) 重现性好,因此应用二维液相色谱分离方法研究蛋白质组的差异有可能成为最有效的方法之一。
1999 年有文献报道,利用NPRP HPLC 方法结合MALDI-TOF MS 检测建立细菌全细胞蛋白表达谱的快速方法[2 ] 。而以高效液相色谱方法(HPLC)为主要技术平台,利用二维液相色谱分离法结合各种质谱联用的多维色谱分离技术主要应用在真核细胞的差异分析,包括药物处理前后人肠腺癌细胞裂解物的比较[3 ] ,人正常卵巢组织细胞与癌细胞蛋白表达图谱的比较研究[4 ] ,以及应用于检测前列腺癌的体液免疫应答和相关的血清标记物的蛋白质芯片的研究中[5 ] 等。至今还未见该二维液相色谱分离法应用于病毒与宿主相互作用研究的报道。
当病原微生物感染进入宿主内部,其基因表达会因为宿主环境的刺激而有所改变,某些毒力也可能只在宿主的体内才会表现。除了重组DNA 的方法外,蛋白质组的研究会对这一过程的阐明提供支持。从病原微生物感染前后宿主蛋白质组的变化来研究二者的相互作用,直接发现蛋白水平的变化,更有可能找到与病原体致病性直接相关的标记物,或在感染过程中发挥作用的关键因子。差异蛋白质组研究在细菌感染和病毒转化的机制研究中已有应用。如:宿主细胞在细菌感染后的不同阶段胞内蛋白表达谱的变化研究[6 ] ,以及EB 病毒转化B 淋巴细胞为永生淋巴母细胞的机制研究[7 ]等。
肠道病毒71 型( Enterovirus 71 , EV71) 是小RNA 病毒科( Picornavi ridae) 肠道病毒属( En-terovirus) 成员, 其感染主要引起患者手足口病(hand-foot-and-mouth disease , HFMD) [8 ] 。自1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离到EV71 病毒[9 ] 以来, EV71已在世界范围内引起十多次暴发与流行[ 10 - 13 ] 。近年来, EV71 病毒的流行在亚太地区呈上升趋势[14 - 16 ] ,并且多以中枢神经系统感染症状出现。多位点基因作用决定毒力,加之复杂的宿主因素等使得明确病毒的毒力与致病机制相当困难。加强病毒和宿主相互作用的研究,是今后的研究重点之一。因此尝试利用目前蛋白质组学研究中的新技术新方法,在建立起病毒感染细胞蛋白质组二维液相色谱分离、分析和比较方法的基础上,根据需要设计取样的时间点,例如病毒感染宿主细胞后不同的时间取样等,再进一步结合质谱的鉴定和相应的功能研究,从病毒与宿主相互作用的角度切入,有助于发现病毒的毒力因子以及与病毒致病相关的宿主因子,从而有可能更深入地阐明病毒的致病机制。同时也为其他病毒致病机理的研究提供了新的思路。
来源：东方医药网