气相色谱法测定真菌的脂肪酸组成

 摘  要：   选用固定液为FFAP的石英玻璃毛细管柱，设置合适的载气柱前压、分流比及程序升温，采用气相色谱法测定了采自云贵高原雪山、雪线附近土壤中的真菌的脂肪酸组成。测定结果表明，此方法能准确分离出真菌中的30多种组分，并鉴定出了主要的8种脂肪酸，筛选出能产生二十碳五烯酸（EPA）的四种真菌。平行测定的相对标准偏差为067%-420%，而且EPA的出峰时间仅为5905 min，只需10 min即可完成一次分析。
关键词：气相色谱法；真菌；二十碳五烯酸（EPA）
中图分类号：O65771；O623617；Q936            文献标识码：A
0  引  言
　　近二十年生物化学、药理学、营养学的研究表明：ω-3多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）具有降低血脂，预防心血管疾病发生和促进大脑发育等特殊生理功效［1-3］。海洋性生物如海洋鱼类、海洋性藻类的油脂中含有丰富的EPA和DHA；另外，一些微生物在其代谢过程中也会产生EPA和DHA。据文献［4-6］报道，产特种油脂的微生物主要有三类，即真菌、藻类和细菌等。真菌作为EPA和DHA的新来源，有无污染、生产周期短、成本低等优点，极有开发潜力。目前国内才开始对此进行研究，还未达到工业化生产阶段。为了监控真菌的发酵过程和筛选能产生EPA或DHA的具有商业价值的菌株，必须有效、准确地测定真菌的脂肪酸组成。
    油脂中的脂肪酸组分一般采用气相色谱法进行分离和测定［7］。目前对植物油、鱼油、海洋生物的脂肪酸测定已有许多相关文献［8-11］，而对真菌脂肪酸组成测定的报道则较为鲜见，而且也没有规范、统一的检测方法。本文在参阅文献［8-11］的基础上，经过多次方法试验，建立了测定真菌脂肪酸组成的气相色谱方法。对采自云贵高原雪山、雪线附近土壤中并经贵州大学虫生真菌实验室发酵培养的多种真菌进行了脂肪酸组成的分析测定。测定结果表明，此方法能准确有效的应用于真菌脂肪酸组成的分析研究，并鉴定出了8种主要脂肪酸，筛选出能产生EPA的四种真菌。平行测定的相对偏差表明方法有较好的精密度和重复性。而且方法简便、快捷。
1  实验原理
    因为油脂中的脂肪酸一般是以甘油酯形式存在，沸点较高，所以可利用快速酯交换先将油脂中的脂肪酸甲酯化后再进行气相色谱测定［7］。不同的油脂有不同的脂肪酸组成，其区别主要是在脂肪酸的碳链上含碳、不饱和键数量的差异，而气相色谱可利用色谱柱将脂肪酸甲酯随着碳原子数的增加，或不饱和键的数量多少来进行分离和测定。
2  实验部分
2.1  实验材料及试剂
真菌：贵州农学院虫生真菌实验室提供。
试剂：0.5 mol/l NaOH-CH3OH溶液；1∶1苯—石油醚混合溶液（试剂均为分析纯）；脂肪酸甲酯标准品（Sigma公司）。
2.2  仪器及测试条件
HP6890气相色谱仪，氢火焰检测器；
固定液为FFAP的石英玻璃毛细管柱，柱长25 m，柱径032 mm；
载气H2：81 kPa；分流比100∶1；燃气H2：30 ml/min；Air：400 ml/min；
进样口：250℃；检测器：250℃；
程序升温：190℃(1 min)—230℃(4 min)，每分钟升6℃。
2.3  真菌脂肪酸的快速甲酯化
    将真菌真空干燥后，取300 mg左右，研碎后放入10 ml具塞试管中，加入1∶1苯-石油醚2 ml，浸提15 min后，再加入0.5 mol/lNaOH-CH3OH溶液2 ml，振摇后置于50℃水浴约15 min，取出后沿管壁加入蒸馏水使有机层上升至试管上部，静置分层后，取上层清液2μl作气相色谱分析。

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