高速逆流色谱法分离纯化环孢菌素

摘  要：  应用高速逆流色谱法对环孢菌素的分离纯化进行研究，选择石油醚/丙酮/水(3:3:2V/V)为
两相体系，计算环孢菌素A、B、C、D在两相体系中的分配系数，以上相为固定相，下相为流动相进行高速
逆流色谱分离纯化，高效液相色谱法测定单组份纯度。实验结果表明一次高速逆流色谱即可将环孢菌素粗
品分离纯化，得到纯度98.5% 以上的环孢菌素A、B、C、D单组份，收率达85% 以上。
关键词 ： 高速逆流色谱； 环孢菌素； 分离纯化
 
1 前言
环孢菌素是由真菌产生的一组环状十一肽物质，由瑞士山道士公司于1976年首次报道，并从其产生菌多孔木霉菌(Tolypocladium. inflatum)的发酵液中分离出二十多个同系物[1]，此后又陆续从其它真菌中寻找到环孢菌素的产生菌[2－6]。环孢菌素具有广泛的生物活性，如环孢菌素A (CyA)已作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植时的抗排斥反应[1]，环孢菌素H是含7个跨膜区域的G-蛋白耦合受体甲酰化多肽受体的强抑制剂[7,8]，环孢菌素D的衍生物PSC-833可作为肿瘤多药耐药逆转剂[9]，环孢菌素C的衍生物具有抗HIV作用等[10]。因此，从环孢菌素产生菌的代谢产物中分离纯化环孢菌素各组分并研究它们及其衍生物的生物活性具有重要的意义。目前分离纯化环孢菌素的方法主要有凝胶色谱，硅胶层析和高压液相色谱等[1]。由于环孢菌素同系物在结构上往往只是个别氨基酸甚至氨基酸构型的差异[1,8]，采用上述基于液-固色谱的分离方法往往很难将这些组分完全分离开来，因此探索环孢菌素新的分离技术具有很强的应用价值。
高速逆流色谱（High Speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC）是国际上于上世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，高速逆流色谱利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相作为固定相，并将一相作为流动相用恒流泵连续输入，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相间反复分配，按在流动相中分配系数的大小而依次得到分离[11-13]。
高速逆流色谱作为一种新型的分离技术，与传统液-固色谱相比具有许多优点。首先，它不用固态支撑体，不存在样品组分的吸附、变性、失活、拖尾等现象，节省了材料和溶媒消耗；其次，它的分离效率高，并且分离时间短，一般几个小时即可完成一次分离；此外，有广泛的液-液分配体系可供选择，体系更换方便、快捷；它的进样量大，这对于样品的纯化制备显示出很大的优势。近年来，随着梯度洗脱、pH区带优化、离子交换顶替、手性选择分离等技术的引入，高速逆流色谱技术将会得到更广泛的应用[14,15]。
本文报道高速逆流色谱在分离制备环孢菌素同系物方面的应用。
2 材料和方法
1.1  实验材料
环孢菌素粗品粉末，福建省微生物研究所提供；高效硅胶板50mm×100mm，青岛海洋化工厂；石油醚(60~90℃)，上海联试化工试剂有限公司；丙酮，汕头达濠精细化学品公司；所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.2  仪器设备
TBE-300高速逆流色谱仪，深圳同田生化技术有限公司；LC-10ADVP高效液相色谱仪（自动进样器、紫外二极管阵列检测器），日本岛津仪器公司；BSZ-100自动分部收集器，上海沪西分析仪器厂。
1.3  实验方法
1.3.1  溶剂系统的选择[14]
溶剂系统的选择对于高速逆流色谱对样品的分离十分关键，要求溶剂可分层、被分离的溶质的分配系数（K）范围在0.2-2。结合实验积累的经验，选择石油醚/丙酮/水（3：3：2）溶剂系统，配制一定量的两相溶剂，静置分层。
1.3.2  确定固定相和流动相
各取2ml上相和下相于小试管中，加入1毫克含环孢菌素A（CyA）、B(CyB)、C(CyC)、D(CyD)的粗品，剧烈振荡1min后静置分层，用毛细管吸取近似等量的上下分层溶液于薄层高效硅胶板上，待溶剂挥发完后用水饱和乙酸乙酯为展层剂，碘蒸汽显色，计算Rf值[16]。进样前的环孢菌素粗品，在TLC板上展开为四个斑点，分别为环孢菌素A、B、C、D组份，它们的Rf值分别为0.56、0.34、0.23、0.69。
分别取上相和下相溶液进行HPLC检测，根据积分面积计算出环孢菌素A、B、C、D组份的分配系数K分别为1.4、0.6、0.2、5.6。选择上相为固定相，下相为流动相。根据K值判断，流动相中环孢菌素C，B，A依次流出，而环孢菌素D应留在固定相中，可以达到分离目的。
1.3.3  固定相保留率的测定
将固定相泵满螺旋柱，开启色谱仪，调节转速到600rpm（正转），然后以2ml/min的恒定速度将流动相泵入螺旋柱，收集主机出口流出的固定相。当主机出口流出流动相时，螺旋柱内固定相和流动相达到动力学平衡状态，此时测量被流动相推出的固定相体积V出，按下式计算固定相保留率ρ（固定相保留率ρ必须≥40%，否则该溶剂系统不适用）。
ρ=（V总-V出）/V总×100%
式中： V总—管路总体积（ml）
       V出—流动相推出的固定相体积（ml）
经计算，固定相保留率ρ=69%。
1.3.3  样品分离方法和组份收集
称取环孢菌素粗品200mg，用流动相配成20ml的样品溶液，在固定相和流动相达到平衡状态后，由进样阀将样品溶液引入螺旋柱，转速600rpm（正转），用流动相以2ml/min的流速洗脱，用分部收集器在进样60min后开始收集，每3min收集一管，每管6ml。
1.3.4  高效液相色谱分析方法
    将收集到的环孢菌素各组分进行高效液相色谱分析，分析条件：Nucleosil C18色谱柱，填料粒径5μm，流动相甲醇：水=80%：20%，流速1ml/min，紫外检测波长205nm，柱温60℃，进样量20μl。
3 结果与分析
3.1  高速逆流色谱分离结果
经高速逆流色谱分离，得到的样品收集管用毛细管点样在高效硅胶板上，用水饱和乙酸乙酯为展层剂，碘蒸汽显色，计算Rf值，将TLC行为相同的收集管合并，收集到的样品可分为三部分。进样450分钟后，停止高速逆流色谱主机运转，用固定相将主机螺旋柱内的液体全部推出，收集为第四部分（表1）。
 
表1   收集到的四部分样品情况
收集时间 收集管数 收集体积（ml） Rf值
第一部分 93-120min 9 54 0.25
第二部分 162-195min 11 66 0.36
第三部分 276-435min 53 318 0.58
第四部分 - - 330 0.70
 
3.2   HPLC测定分析结果
3.2.1  进样前样品组份及含量分析
进样前环孢菌素粗品经HPLC分析，主要含有环孢菌素C、B、A、D四个组份（图1）, 各组份含量见表2。
表2   环孢菌素粗品组份含量与重量
含量（%） 重量（mg）
Cyclosporin C 9.1 18.2
Cyclosporin B 5.8 11.5
Cyclosporin A 76.4 152.8
Cyclosporin D 6.2 12.5
 
图1 进样前环孢菌素粗品HPLC图
环孢菌素C、B、A、D组份保留时间分别为
10.86min、11.95min、13.46min、16.05 min
 
表3   HSCCC分离后环孢菌素各组份纯度和收率
HPLC测定组份名称 重量（mg） 纯度（%） 收率（%）
第一部分 Cyclosporin C 15.5 99.3 85.0
第二部分 Cyclosporin B 10.2 98.7 88.5
第三部分 Cyclosporin A 137.8 98.6 90.2
第四部分 Cyclosporin D 10.8 98.5 86.3
 
3.2.2分离后环孢菌素各组份纯度和收率
将收集得到的四部分样品经HPLC分析，分别为环孢菌素A、B、C、D，见表3和图2~5。
 
图2  HSCCC分离后环孢菌素C组份HPLC图
CyC保留时间10.82min
 
图3 HSCCC分离后孢菌素B组份HPLC图
CyB保留时间11.92min
 
     图4  HSCCC分离后环孢菌素A组份HPLC图
CyA 保留时间13.49min
 
图5  HSCCC分离后环孢菌素D组份HPLC图
CyD保留时间16.04min
4 结论
通过本实验可得出以下结论：
（1）在石油醚/丙酮/水(3:3:2V/V)为两相系统条件下，用高速逆流色谱分离环孢菌素粗品，根据分配系数KC《KB《KA，依次收集得到环孢菌素C、B、A组份，分配系数较小的组份最先被洗脱出来。
（2）由于环孢菌素D组份的分配系数K=5.6，即其在上相中的溶解度远大于在下相中的溶解度，本实验采用进样450分钟后，停机用固定相将主机内的液体全部推出，将收集液浓缩蒸干得到环孢菌素D组份。若该方法得到的环孢菌素D组份纯度不高，选择下相为固定相，上相为流动相，将收集液浓缩后进行第二次高速逆流色谱分离，可以分离到高纯度的环孢菌素D单组份，这一方法已在本实验中得到验证。
（3）实验中进样量达到200毫克，在8个小时内完成分离，实现了比高效液相更为有效的制备分离和提纯；
（4）利用高速逆流色谱可以有效地将环孢菌素粗品中的A、B、C、D组份分离出来，样品纯度高、回收率高，并且有很好的重复性；
（5）本实验方法经调整溶剂系统比例和操作条件后，应用于环孢菌素发酵粗品的分离，有可能从中分离得到其它环孢菌素同系物。
高速逆流色谱作为一种有效的新型分离技术用于环孢菌素同系物的分离，效果十分理想。较高的进样量、较好的分离能力、较高的样品回收率以及没有不可逆吸附等特点，决定了它在抗生素单组份标准品制备、多组份同系物分离纯化鉴定及抗生素研究开发领域将得到越来越广泛的应用[17]。我国是世界上较早开展逆流色谱技术的国家，并且在中草药的分离纯化上得到广泛应用[12,18-19]，但在抗生素的分离纯化上报道很少[20]，与国外相比，有很大的差距。因此，在我国开展高速逆流色谱技术在抗生素分离纯化方面的工作有着广阔的应用前景。

参 考 文 献 [略]