点击显示 收起
荧光素钠为一诊断用药，用于眼角膜损伤、眼底血管造影诊断及血液循环时间的测定。USP(ⅩⅩⅢ)［1］、BP(1998)［2］、日本药局方(1993)［3］及中国药典(1995年版)［4］均收载了该品种及其制剂。其中BP(1998)、日本药局方(1993)及中国药典(1995年版)的含量测定方法均为重量法，USP(ⅩⅩⅢ)的含量测定方法为荧光分析法。重量法操作繁琐，费时，步骤多，易产生误差。荧光法因灵敏度高，故对溶剂、器皿的洁净度要求较高，且荧光仪的应用普及程度不高。本文建立的反相高效液相色谱法可以克服上述缺点，经方法学验证试验证明方法可行，测定结果较为满意。
1 仪器与试药
岛津高效液相色谱仪(岛津SPD-10A检测器，岛津C-R6A数据处理仪)。
甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钠(分析纯)。
样品及对照品(含量99.8%)均由美国爱尔康医药有限公司提供。
2 色谱条件
色谱柱：SpherecLone 5 μm,150 mm×4.60 mm，美国Phenomenex；流动相：0.1 moL.L-1磷酸二氢钠溶液(pH 4.4)-甲醇(1∶1)；流速：1 mL.min-1；检测波长：235 nm；进样量：10 μL;AUFS:0.16。
3 线性范围
精密称取荧光素对照品约35 mg置50 mL量瓶中，加10%的氢氧化钠溶液1 mL使荧光素溶解，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。
分别精密量取储备液1.7，1.9，2.0，2.2，2.3 mL置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，各精密量取10 μL注入色谱仪，记录色谱图，以浓度(mg.mL-1)对峰面积计算回归方程为：
A=1.079 4×108C+3.346 5×104 r=0.999 7
说明荧光素在0.024～0.033 mg.mL-1的浓度范围内呈良好的线性。
4 回收实验
精密量取荧光素钠注射液3 mL置200 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取此溶液1 mL及对照品储备液2 mL置同一200 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取10 μL注入色谱仪，记录色谱图，计算平行5次测定的结果，平均回收率为99.99%，RSD为0.99%。
5 精密度与重现性
取同一样品溶液重复5次注入色谱仪，记录色谱图，计算峰面积的RSD为0.33%。同法配制5份样品溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，计算样品的含量RSD为0.95%。
6 样品测定
精密量取对照品储备液2 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取样品溶液3 mL置200 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液1 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取上述2种溶液各10 μL，注入色谱仪，记录色谱图，按外标法计算供试品中荧光素的含量。3批样品结果分别为91.02%，97.36%，95.28%，n=3。用重量法［4］测得结果分别为91.98%，98.03%，94.41%，n=2。
7 讨论
7.1 取荧光素对照品溶液在200～600 nm波长处扫描，在235 nm处有最大吸收，故确定检测波长为235 nm。
7.2 笔者最初采用甲醇-水作为流动相，结果峰形对称性不好，峰形宽，保留时间也较长，加入磷酸二氢钠后，峰形可以得到改善，随着磷酸二氢钠浓度的增加，主峰保留时间缩短。甲醇的比例增大，保留时间也缩短。综合上述影响因素，确定了本文采用的流动相，色谱图见图1。
图1 样品色谱图
1.荧光素钠
7.3 中国药典1995年版采用的重量法需要萃取、洗涤6次，还需蒸干，恒重，操作步骤多，周期长，繁琐，结果的重现性不好。而本文建立的方法准确，操作简便，省时，重现性好，经实验证明方法可行，可为新版中国药典荧光素钠及注射液的含量测定方法的改进提供参考。
代红（北京市药品检验所 100035）
田洪昭（北京市药品检验所 100035）
余立（北京市药品检验所 100035）
参考文献