摘 要 建立了同时测定大鼠胆汁中4种盐酸非洛普(DDPH)Ⅰ相代谢物的HPLC方法。胆汁样品经盐酸水解后以Alltech C18固相萃取小柱纯化富集，然后进行HPLC分析。色谱柱为Hypersil ODS2 10 μ 30 cm×4.6 mm ID，流动相为甲醇-水-三乙胺-冰乙酸(450∶550∶1∶0.7)，检测波长为278 nm。测定了ip DDPH后大鼠胆汁中4个DDPH代谢物的体内动态。结果表明M1和M2为DDPH主要体内代谢产物。给药后5 h DDPH代谢产物的胆汁累积排泄量已达胆汁总排泄量的75%～80%。给药后0.5～1h时间段DDPH代谢物的胆汁排泄速率达峰值。
关键词 盐酸非洛普； 代谢物； 高效液相色谱法； 固相萃取； 测定； 胆汁
盐酸非洛普(phenoprolamine hydrochloride)的化学名为1-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙胺基)丙烷盐酸盐(DDPH)。DDPH是在研究慢心律衍生物的过程中得到的一个兼具弱钙拮抗活性的α1-受体拮抗剂，现正作为降压新药开发［1～3］。DDPH在体内代谢较快，其体内主要Ⅰ相代谢产物为M1、M2、M3和M4，结构如下：
No. R1 R2 R3 R4
DDPH H H CH3 CH3
M1 H H H CH3
M2 H OH CH3 CH3
M3 OH H CH3 CH3
M4 OH H CH3 H
为了研究DDPHⅠ相代谢产物在大鼠胆汁中的动态及判定胆汁中主要的DDPHⅠ相代谢产物，本文设计了同时测定大鼠DDPH代谢产物的HPLC方法，并用该法测定了ip DDPH后不同时间段上述4种代谢产物在大鼠胆汁中的排泄情况。
1 仪器及试药
Shimadzu LC-6A平流泵；Waters 486TM可变波长紫外吸收检测器；HS色谱数据工作站Ver 3.4 for DOS(杭州英谱科技开发有限公司)500 mg 6ml Alltech C18固相萃取小柱(Cat No.205350)M1、M2、M3、M4对照品(中国药科大学有机化学教研室合成，纯度高于99.5%)甲醇、冰乙酸、三乙胺均为分析纯；L-半胱氨酸(上海康达氨基酸厂，批号980601)。
标准溶液：M1，M2，M3，M4均配成100.0 μg/ml的甲醇溶液。雄性SD大鼠由中国药科大学动物室提供。
2 实验方法
2.1 色谱条件
色谱柱为Hypersil ODS2 10 μ 30 cm×4.6 mm ID，流动相为甲醇-水-三乙胺-冰乙酸(450∶550∶1∶0.7)，流速1 ml/min，检测波长278 nm，灵敏度为0.001AUFS，温度为20℃。
2.2 大鼠胆汁样品的采集
取健康成年雄性SD大鼠3只，以5 ml/kg的剂量ip 20%乌拉坦溶液，待大鼠麻醉后将其固定于鼠板上，打开腹腔，作胆管插管，插管后以2 ml/kg的剂量ip 5 mg/ml的DDPH溶液，于给药后0～0.5，0.5～1，1～1.5，1.5～2，2～3，3～4，4～5，5～6，6～8，8～12和12～24 h 10个时间段分别收集胆汁，每个时间段以ip方式补充生理盐水1 ml。
2.3 胆汁样品的测定方法
取胆汁样品0.5 ml，置10 ml离心管中，加入L-半胱氨酸20 mg，浓盐酸0.2 ml，涡旋10 s，加塞密封后于100℃水浴水解30 min，取出放冷后以3500 r/min离心5 min，取上清液以1 mol/L NaOH溶液调节pH 6～7，供C18小柱预处理用。
取Alltech C18固相萃取小柱一根，以10 ml甲醇洗脱活化，再以10 ml水洗去甲醇，将上述调节pH至6～7的胆汁样品滤过C18小柱，弃去滤过液，小柱依次分别以10 ml水，10 ml甲醇-水(1∶10)洗脱，弃去洗脱液，小柱再以5 ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，于40℃水浴以氮气流吹去甲醇，残渣加200 μl流动相，涡旋10 s后以3500 r/min离心5 min，取上清液20 μl供HPLC分析，色谱图见图1。M1，M2，M3，M4的保留时间分别为73.7，38.3，28.0和19.5 min。
Fig 1. Chromatograms of (A)blank rat bile, (B)blank
rat bile with metabolite M1,M2,M3 and M4, (C)rat bile
after ip administration of DDPH
3 结果
3.1 线性关系考察
取离心管数支，分别精密加入不同量的M1，M2，M3和M4的标准溶液，以1 ml空白大鼠胆汁配成含M1和M2分别为30.0，60.0，120.0，250.0，500.0，1000.0 μg/ml，含M3分别为10.0，20.0，40.0，80.0，160.0，320.0 μg/ml,含M4分别为5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160.0 μg/ml的系列标准胆汁液，按“胆汁样品的测定方法”项下操作，记录峰面积。以各代谢物的峰面积(Y)对浓度(C)进行回归计算，结果表明4种DDPH代谢产物在上述各自浓度范围内线性良好。在30.0～1000.0 μg/ml浓度范围内M1和M2的回归方程分别为：Y=7996.5C-25131，r=0.998; Y=11067C-107367，r=0.999。在10.0～320.0 μg/ml浓度范围内M3的回归方程为Y=17094C-25789,r=0.998。在5.0～160.0 μg/ml浓度范围内M4的回归方程为Y=22259C-65493,r=0.998。
3.2 精密度试验
按“线性关系考察”项下操作配制含M1和M2的浓度分别为60.0，250.0，1000.0 μg/ml，含M3的浓度分别为20.0，80.0，320.0 μg/ml，含M4的浓度分别为10.0，40.0，160.0 μg/ml的低、中、高三种浓度的标准胆汁液，每种浓度5份,进行分析，记录峰面积。测得M1、M2、M3、M4在低、中、高三种浓度的RSD(%,n=5)分别为：5.7，3.9，2.7; 5.2，3.6，3.1；6.3，4.5，2.5；7.1，5.0，3.3。
3.3 回收率试验
按“精密度试验”项下操作，配制M1、M2、M3、M4低、中、高三种浓度的标准胆汁液，每种浓度5份，进行分析，记录峰面积(YX)。另分别取M1、M2、M3、M4标准溶液适量于离心管中，配成与上述三种浓度相一致的甲醇溶液，取各浓度的甲醇溶液0.5 ml以氮气流吹干，残渣以200 μl流动相溶解，进行HPLC分析，记录峰面积(YS)。胆汁中各代谢物的回收率(%)=YX/YS×100%。结果表明M1、M2、M3、M4低、中、高三种浓度标准胆汁的回收率(%,n=5)及RSD(%)分别为：86.1(5.3)，93.5(3.5)，98.9(2.1) 98.2(5.4),98.3(3.8)，96.9(2.6)91.3(7.1)，92.4(4.2)，93.3(3.0) 84.2(6.9), 87.1(4.6), 91.6(2.5)。
Fig 2. Accumulative amount of metabolite M1,M2,M3 and M4,
in rat bile after ip administration of DDPH
3.4 大鼠胆汁中DDPH代谢产物的动态研究
大鼠ip DDPH后，4种代谢物在不同时间段从胆汁中排出的累积量见图2，各时间段从胆汁中排出速率见图3。从图2可见M2为DDPH的主要Ⅰ相代谢产物，其次是M1，各代谢物转化率的顺序为M2＞M1＞M4＞M3。给药后5 h，DDPH代谢物的胆汁累积排泄量已达胆汁中总排泄量的75%～80%。由此可见DDPH在体内代谢速度较快。从图3可见，M1、M2、M3、M4在0.5～1 h时间段排出速率达峰值。
Fig 3. Excretive rate curve of metabolite M1,M2,M3 and
M4, in rat bile after ip administration of DDPH
—□— M1; —▲— M2; —●— M3; —×— M4
4 讨论
本实验采用Alltech C18固相萃取小柱对胆汁样品中的DDPH Ⅰ相代谢物进行纯化富集。胆汁水解样品上柱后，先以10 ml水洗脱水溶性杂质，如NaCl等，再以甲醇-水(1∶10)进一步洗去胆汁中的一些内源性杂质，然后再用甲醇将小柱中的DDPH代谢物洗下，以氮气流吹干浓缩。实验中曾考察了以①甲醇-水(1∶20)，②甲醇-水(1∶10)和③甲醇-水(1∶5)三种洗脱液对上柱后的样品进行纯化。结果表明，以①纯化后的样品色谱图中杂峰仍较多，干扰物对M4的测定仍有一定影响；以②和③纯化的样品色谱图中杂峰较少，4个DDPH代谢物出峰均未受到干扰，但洗脱液③中有少量M4被洗脱下来，而洗脱液②并无此现象，故胆汁上柱后，选择洗脱液②来纯化样品。
江苏省自然科学基金资助项目（BK970077）
丁黎(中国药科大学药物分析学教研室)
张正行(中国药科大学药物分析学教研室)
陈浩(中国药科大学药物分析学教研室)
戴路(中国药科大学药物分析学教研室)
倪沛洲(有机化学教研室)
王广基(新中新药研究中心， 南京 210009)
安登魁(中国药科大学药物分析学教研室)
参 考 文 献
1，倪沛洲，钱家庆，唐伟方等.一种抗
高血压药物苯氧烷胺类化合物的结晶的制作方法.CN1031369C
2，倪沛洲，彭久合，夏霖等.α1-受体拮抗剂DDPH类似物的合成及其降压活性.中国药科大学学报，1992，23(4)：203
3，彭久合，夏 霖，倪沛洲等.α1-受体拮抗剂DDPH相关的芳氧烷胺类化合物的合成与降压活性.中国药科大学学报，1998，29(2)：81
作者：
丁黎,张正行,陈浩,戴路,倪沛洲,王广基,安登魁 2007-5-18