液相色谱/蒸发光散射测定转基因烟草提取液中海藻糖含量

液相色谱/蒸发光散射测定转基因烟草提取液中海藻糖含量
魏 泱     丁明玉*
(清华大学化学系，北京，100084)
摘要：采用动态修饰氨基柱分离，蒸发光散射检测测定了转基因烟草提取液中的糖。四种糖的峰面积标准曲线在100~1500mg/L范围内均具有良好的线性关系。本方法对果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖的检测下限分别为10mg/L，20mg/L，10mg/L和10mg/L。

关键词：高效液相色谱法，动态修饰氨基柱，蒸发光散射检测法，转基因烟草提取液，海藻糖

中图分类号：O658

海藻糖(trehalose)是由两分子葡萄糖通过a-a-(1®1)糖苷键链接的非还原性双糖。许多生物体在遭遇酷热、干旱、高渗和重金属离子等不良环境时能在体内合成高浓度海藻糖。研究表明外加海藻糖可以起到保存生物活性物质的作用，因此目前它在食品、化妆品和医药等方面得到了愈来愈广泛的应用[1]。中国科学院微生物研究所的戴秀玉等[2]成功地分离了大肠杆菌中的海藻糖合成酶基因，并采用植物基因工程技术将该基因引入烟草，使转基因烟草植株内合成并累积海藻糖，从而提高转基因烟草的抗干旱、耐盐碱能力。
本文的目的在于建立一种定量分析转基因烟草提取液中海藻糖的方法。传统定性分析海藻糖的方法主要是纸层析和薄层层析法；纸层析法也可作为定量分析海藻糖的方法，但其定量的准确度和重现性都无法与高效液相色谱法(HPLC)相比[3]。在HPLC分析糖的色谱柱中，化学键合氨基柱因分离效率高而被广泛采用。但由于柱填料自身的水解和固定相上的氨基与糖的羰基之间易形成希夫碱，缩短了其使用寿命[4]。在流动相里加入某些胺作为改善剂，可以动态修饰硅胶柱或C18柱，得到与化学键合氨基柱柱效相当的动态修饰柱，且由于柱上吸附的有机胺不断得到更新，分析柱可以长时间保持稳定[5-7]。糖本身在通常的紫外区无吸收，采用低波长紫外检测干扰较大。对糖的直接检测往往利用差示折光检测器(RID)来进行，但RID灵敏度较低且不能用于梯度洗脱。衍生化法可以很大程度提高对糖的检测灵敏度，但衍生化操作繁琐且不可避免地会引入误差。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种半通用型的检测器[8]，可以直接对糖进行检测，且具有较高的灵敏度。本文利用乙二胺动态修饰硅胶柱和蒸发光散射检测器，建立了一种可靠的直接测定转基因烟草提取液中糖的HPLC/ELSD方法。
1.实验与方法
1.1仪器与试剂
HP1100高效液相色谱仪(美国Hewlett Packard公司产品)：配有四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD)和化学工作站。另配有Alltech 500 ELSD(美国Alltech公司产品)。
果糖购自北京市西中化工厂，葡萄糖购自北京瀛海精细化工厂，蔗糖购自北京化工厂，海藻糖购自Sigma公司，均为分析纯；乙腈为色谱纯，购自Scharlau公司(Spain)；乙二胺购自中国医药公司，氢氧化铵购自北京朝阳区金盏化工厂，均为分析纯。水为去离子水。流动相使用前用0.45mm滤膜过滤。
配制浓度均为2000mg/L的四种糖贮备水溶液，使用前用水稀释成适当浓度的工作溶液。
烟草提取液经脱蛋白、核酸处理后，用高速离心机离心，上层清液用0.45mm的滤膜过滤，滤液用水稀释5倍后，直接进行HPLC分析。
1.2 色谱条件
色谱柱：Zorbax RX-SIL (4.6 mm i.d.´250 mm, 5 mm)硅胶柱，HP公司产品；配有预柱Zorbax Rx-SIL (4.6 mm i.d. ´12.5 mm, 5 mm)硅胶柱，HP公司产品。先用含体积分数0.3%乙二胺的乙腈/水(体积比2.6:1)溶液200mL冲洗色谱柱，再以含体积分数0.03%乙二胺的乙腈/水(体积比2.6:1)作为流动相，流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量20 mL；ELSD参数：漂移管温度85 ℃，氮气流速2.0 L/min。
2. 结果与讨论
2.1分离条件的选择
在流动相里加入二胺或多胺，它们的氨基可以与硅胶表面的硅醇基产生氢键作用而吸附在硅胶表面，在浓度适中的情况下，这些二胺或多胺完全覆盖硅胶表面形成致密单层，吸附在柱上的胺可以与流动相中的胺不断地交换得到更新，形成动态修饰的氨基柱。糖可以通过与二胺或多胺未被吸附的氨基形成氢键在柱上保留，使不同的糖得到分离。以前的研究者成功地利用对二氮己环[5]、四乙撑五胺[6]等二胺或多胺和长链烷基胺[7]修饰了硅胶柱和C18柱，但由于这些胺的低挥发性，不适合于蒸发光散射检测。乙二胺是最易挥发的二胺，因此本文选取它作为胺修饰剂。分析前先用含较高乙二胺浓度（体积分数0.3%）的溶液200 mL冲洗色谱柱，以保证硅胶表面完全由吸附的乙二胺覆盖。实验发现，在分析过程中，乙二胺体积分数在0.03%~0.1%范围内，对糖的分离几乎没有影响，本文采用体积分数为0.03%的乙二胺作流动相。pH值对胺的修饰作用具有较大的影响，pH较低会使氨基离子化，不能与硅胶表面的硅醇基产生氢键作用，从而达不到修饰硅胶柱的目的，而过高的pH值将影响到硅胶柱的稳定性，本文采用0.05%氢氧化胺调节pH约为9。
流动相中水的含量对糖的保留影响较大，采用乙腈/水(体积比2.6:1)作为流动相，四种糖可以在适当的时间内得到较好的分离。果糖和葡萄糖未完全达到基线分离，减小水的含量可以继续改善其分离情况，但将大大增加分离时间。
在选定的最佳条件(见1.2节)下得到的糖标准混合物和烟草提取液的色谱图分别如图1和图2所示。
 
图1：四种糖标准溶液的ELSD检测色谱图
Fig. 1 LC-ELSD Chromatogram of a standard mixture of four carbohydrates
1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 海藻糖
1. fructose  2. glucose  3. sucrose  4. trehalose
 


 
 
图2 样品的ELSD检测色谱图
Fig. 2 LC-ELSD Chromatograms of samples
(A)野生烟草提取液  (B)转基因烟草Ⅰ提取液 (C) 转基因烟草Ⅱ提取液
(A) Wild tobacco extracts  (B) Transgenic tobacco extracts Ⅰ 
 (C) Transgenic tobacco extracts Ⅱ
1. 果糖 2. 葡萄糖 4. 海藻糖
1. fructose  2. glucose   4. trehalose
2.2 ELSD条件优化
根据流动相的种类和比例，首先设漂移管温度80 ℃，氮气流速2.2 L/min。保持气速不变，改变漂移管温度，观察信号基线水平和噪音，85 ℃时流动相基本挥发，噪音不是太大。固定漂移管温度为85 ℃，观察不同氮气流速时糖的信号强度，2.0 L/min为在较小噪音水平上，产生最大检测响应值的最低气速。故选定漂移管温度为85 ℃，氮气流速为2.0 L/min。
2.3 线性范围与检出限
将贮备液稀释配成100，200，400，800，1200，1500 mg/L的系列浓度，依次进样20 mL，根据ELSD测得的峰面积(A)对相应的标准溶液浓度(C)进行线性回归。将最小浓度的标准溶液再逐级稀释，依次进样20 mL，计算当信噪比为3时，对应的标准溶液的浓度以确定检出限。结果见表1。
表1 四种糖的定量分析参数
Table 1 Parameters of quantitative analysis for four carbohydrates
糖Carbohydrate 线性范围Linear range(mg L-1) 校正曲线Calibration curve  校正因子Calibration coefficient (r) 检测限Detection limit/(mg L-1)
果糖fructose 100~1500 A=-32.71+5.46C 0.998 10
葡萄糖glucose 100~1500 A=-55.96+2.43C 0.999 20
蔗糖sucrose 100~1500 A=-197.44+6.42C 0.998 10
海藻糖trehalose 100~1500 A=-269.01+5.84C 0.997 10
目前，ELSD的检测理论尚不完善，许多实验表明，ELSD的响应值(峰面积)与被测物浓度的关系曲线比较复杂，随实验条件和被分析物质不同而变化。在本文所采用的条件下，四种糖的峰面积与其浓度之间呈良好的线性关系。
2.4样品的测定
对同一份样品，重复进样5次，测定其峰面积，取5次测定平均值计算样品中糖含量。在样品溶液中加入已知量的糖标准溶液，测定其回收率。结果见表2。
表2 稀释5倍的样品中糖含量的测定结果
Table 2 Determination results of carbohydrates in 5-folds diluted samples (n=5)
样品Samples 糖Carbohydrates 平均值Mean (mg L-1) 回收率Recovery (%) 相对标准偏差RSD (%)
野生烟草提取液Wild tobacco extracts 果糖fructose 1157.64 97.20 1.42
葡萄糖glucose 919.33 96.47 2.85
转基因烟草Ⅰ提取液Transgenic tobacco extracts Ⅰ 果糖fructose 1119.36 102.31 2.06
葡萄糖glucose 910.27 103.15 2.10
海藻糖trehalose 159.42 96.21 4.02
转基因烟草Ⅱ提取液Transgenic tobacco extracts Ⅱ 果糖fructose 999.21 98.50 1.47
葡萄糖glucose 934.55 101.73 2.78
海藻糖trehalose 489.56 99.04 1.90
尽管提取液经过了脱蛋白和核酸处理，但由于植物提取液的组份很复杂，从ELSD检测图来看，其中还含有大量的可溶性杂质。由于糖在氨基柱上有较强的保留，而杂质在6 min前都可以完全洗脱，对糖的检测没有产生干扰。在对糖的检测过程中，基线平稳。野生烟草提取液中仅含有果糖和葡萄糖，转基因烟草提取液有海藻糖，说明海藻糖合成酶基因引入野生烟草后，转基因烟草植株内合成并累积了海藻糖。
Herbreteau等[9]采用含少量水的二氯甲烷/甲醇混合溶液作为流动相，在硅胶柱上分离未衍生的糖，他认为该体系分离糖具有较高的效率。我们在对这种体系分离上述四种糖的研究中发现，只有采用很高比例的二氯甲烷溶液，果糖和葡萄糖才能得到较完全的分离，在等度洗脱的情况下，蔗糖和海藻糖的保留时间将很长，而且由于二氯甲烷量的增大，糖在流动相中溶解性变差，使峰拖尾现象变得很严重。通过比较两种体系，我们认为乙二胺动态修饰硅胶柱分离糖具有较高效率，出峰时间合理。采用这种分析柱，流动相中可以含较高比例的水，从而增加了糖的溶解性，减小了峰拖尾现象。

参考文献