反相高效液相色谱法和气相色谱法测定盐酸芬氟拉明片含量的比较研究

目的：研究一种用反相高效液相色谱测定盐酸芬氟拉明(FH) 片含量的方法，并与法定气相色谱法作比较研究。方法：以水为溶剂处理样品，采用Alltima C₁₈柱为色谱柱，以0.05 mol^.L^-1磷酸液(用三乙胺调pH 2.5)-甲醇(50∶50)为流动相，紫外检测波长254 nm ，流速1.0 mL^.min^-1，柱温30 ℃。 结果：FH浓度在0.20～1.0 mg^.mL^-1浓度范围内呈良好线性关系(r= 0.999 9)，最低检测浓度为2.5 μg ^.mL^-1,日内、日间精密度(RSD)分别为0.9%(n=4)和0.7%(n=6)，平均 回收率为99.4%，RSD=1.0%(n=5)。 结论：高效液相色谱法采用水作溶剂，辅料不干扰测定，所得结果与理论值一 致；而气相色谱法采用氯仿作溶剂，不同的处方其辅料对FH的溶出有干扰，可能导致测定 结果偏低，应引起重视。
关键词　盐酸芬氟拉明　反相高效液相色谱法　气相色谱法　比较研究

盐酸芬氟拉明(fenfluramine hydrochloride,简称FH)为苯丙胺类食欲抑制药 。其原料药和片剂均为中国药典1995年版二部新增品种，含量测定方法分别为非水碱量法和 气相色谱法^［1］，文献报道还有酸性染料比色法^［2］和阴离子表面活性剂滴定法^{［ 3］}。作者在用气相色谱法^［1］测定不同厂家生产的FH片含量时发现，不同的处方 其辅料对片剂的含量测定有影响。为了进一步考察其影响的程度，我们建立了以十八烷基硅 胶键合相的色谱柱为分析柱，以改性的甲醇-水为流动相的高效液相色谱法测定FH片的含量 ，并与气相色谱法^［1］测定的值作比较，现将结果报道如下：

1　仪器与试药

1.1　仪器　美国Waters高效液相色谱仪，510输液泵，484可变波长紫外 检测器，745B色谱数据处理机，TCM色谱柱温控制仪，7725i进样阀(定量管20 μL)；日本岛 津GC-14B气相色谱仪；浙江大学N-2000型色谱工作站；梅理特AE-240电子天平(十万分之一) ；CQ-250超声波清洗器。
1.2　试药　FH对照品(中国药品生物制品检定所，批号0073-9501)；FH 片：规格为每片20 mg，薄膜衣片，分别由A、B、C、D4家药厂提供或市售品；内标物：正十 四烷(美国Sigma公司)；甲醇(色谱纯，上海吴泾化工厂)，磷酸、三乙胺和氯仿均为分析纯 ；水为蒸馏水。
2　高效液相色谱法
2.1　色谱条件与系统适用性试验　色谱柱：Alltima C₁₈柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相：0.05 mol^.L^-1磷酸液(用三乙胺调pH 2.5)-甲醇(50∶50)；流速1.0 mL^.min^-1; 检测波长：254 nm；进样量：20 μL；纸速0.25 cm^.min^-1；ATT=256；柱温：30 ℃。在此色谱条件下，得色谱图见图1。FH的峰形对称，理论板数大于2 500。

图1　高效液相色谱图
A.对照品　B.样品
1.盐酸芬氟拉明

2.2　线性关系　精密称取经105 ℃干燥至恒重的FH对照品50. 25 mg，置25 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取此液1.0， 2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。在本文给定的色 谱条件下进行测定，记录色谱图，以FH浓度C( mg^.mL^-1)和相应的峰面积A( ×10^-6)绘制标准曲线，结果表明当FH浓度在0.20～1.0 mg^.mL^-1范围内 与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：
C=-0.023 4+0.314A　r=0.999 9
2.3　精密度考察　取样品含量测定项下的同一份溶液，连续进样6次， 求得FH峰面积的RSD=0.2%；另取同一份样品的2份溶液，于日内不同时间分别进样测定 ，求得日内含量的RSD=0.9%(n=4)；于日间连续测定3 d，求得日间含量的RSD =0.7%(n=6)。
2.4　重现性试验　按含量测定项下的方法，取同一批样品5份进行测定 ，求得含量的RSD=0.6%(n=5)。
2.5　回收率试验　按处方配比，称取一定量空白辅料，置100 mL量瓶中 ，精密加入FH对照品溶液适量，浓度按±20%范围变动，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照 “样品含量测定”项下方法操作，求得平均回收率为99.4%，RSD=1.0%，n=5。
2.6　最低检测浓度　按信噪比(S/N)=2时，最低可检测浓度为2.5 μg^.mL^-1，最小检出量50 ng。
2.7　样品含量测定　取不同厂家生产的样品8批，每批各20片，除去薄 膜衣，精密称重，研细，精密称取适量(约相当于FH 60 mg)，置100 mL量瓶中，加水溶解并 稀释至刻度，摇匀，滤过，按本文给定的色谱条件测定；另取0.60 mg^.mL^-1的FH对 照品溶液，同法测定，按外标法的峰面积计算。色谱图见图1，结果见表1。

表1　样品含量测定结果(标示量%，n=5)

注：括号内为RSD(%)值

3　气相色谱法^［1］

3.1　色谱条件与系统适用性试验　色谱柱：玻璃柱2 m ×3 mm；填充剂：10%PEG-20M和2%氢氧化钾/硅烷化102白色担体40～60目；柱温为145 ℃； 进样温度为200 ℃，检测器温度为220 ℃；检测器：FID；气体流速：氮气60 mL^.m in^-1，氢气50 kPa，空气50 kPa；量程：10²；衰减：5；纸速：3.2 mm^.min -1；进样量：0.6 μL。色谱图见图2。理论板数与分离度均符合规定。

图2　气相色谱图
A.对照品　B.样品
1.正十四烷(内标)　2.盐酸芬氟拉明

3.2　校正因子测定　精密称取经105 ℃干燥至恒重的FH对照品约50 mg(2份)，置10 mL量瓶中，精密加入0.4%正十四烷氯仿液5.0 mL，溶解，在上述给定的 色谱条 件下取样测定，记录色谱图，用峰面积计算校正因子，求得7次的平均校正因子为1.330 8 ，RSD=0.84%。
3.3　样品含量测定　精密称取“2.7”项 下含量测定样品细粉适量(约相当于FH 50 mg)，置10 mL量瓶中，精密加入0.4%正十四烷氯 仿液5.0 mL，溶解，滤过，照“校正因子测定”项下操作，计算含量，色谱图见图2，结果 见表1。

4　讨论

4.1　经试验用水-甲醇(50∶50)作流动相，FH出峰时间长，且 不成峰形 ，增加甲醇比例，峰形未改善。本文选择三乙胺作封尾剂，磷酸调pH 2.5～3.5，保持甲 醇比例不变，大大提高洗脱能力，但容量因子k′不随pH的变化影响，而随着甲醇比例 的增大而减小。经过反复实验筛选，确定流动相组成为0.05 mol^.L^-1磷酸液(用三 乙胺调节pH 2.5)-甲醇(50∶50)。在该流动相条件下，色谱峰形尖锐，对称，FH保留时间 约为5.1 min，k′约2.5，理论板数大于2 500，达到了快速分析的目的。
4.2　实验发现，柱温对FH峰形与内标物之间的分离度影响较大，提高柱 温，2者出峰时间缩短，峰形改善，故选择柱温145 ℃；提高进样口温度，FH峰柱效增加， 故选择进样口温度为200 ℃；提高载气流速，柱效增加，以选择60 mL^.min^-1为宜。 在 给定的色谱条件下测定，FH峰与内标物峰达到了基线分离，系统适用性试验符合要求，见图 2。经多次测定校正因子，其RSD均小于2%。
4.3　由表1数据表明，A、D 2厂样品其气相色谱法比高效液相 色谱法测 得含量大约低8%～11%，B、C 2厂样品用上述2法测定的含量基本一致。通过对A厂生产工艺 考察，工艺稳定，用实际投料量计算样品的理论含量，其值与高效液相色谱法测定结果一致 ，而气相 色谱法测定值则低约10%。据了解，A、D 2厂均按同一处方生产，所用辅料相同，所得结果 一致。经分析，作者认为是由于气相色谱法用氯仿作溶剂，A、D 2厂处方中辅料干扰了FH在 氯仿中的溶出，使溶解不完全，导致用气相色谱法测定结果不能真实反映样品中的实际含量 。
4.4　经对剥薄膜衣和不剥薄膜衣的样品作对照测定，结果表明 ，薄膜衣材料不干扰本法的测定，故不用剥薄膜衣，省时、经济。
4.5　本文建立用高效液相色谱法测定FH片的含量，具有方法简便、灵敏 ，准确性和重现性均好的特点，不受辅料干扰，较真实地反映了样品的实际含量，为该药的 质量控制提供了一种新方法。

徐宏祥（浙江省嘉兴市药品检验所　嘉兴　314001）
韩伟东（上海交大昂立穗轮药业有限公司 　浙江平湖　314204）

参考文献
1，中国药典.1995.二部：625，626
2，王玉，王丽，宋瑞雪.酸性染料比色法测定盐酸芬氟拉明片含量.药物分析杂 志，1995，15(4)：40
3，王玉，李伟.盐酸芬氟拉明片的含量均匀度测定.药物分析杂志，1995，15(5 )：42