付春梅 李章万 刘三康 陈聪
付春梅（本校99届研究生）；李章万 刘三康 陈聪（华西医科大学
药学院 成都 610041）
关键词: 反相高效液相色谱法；
中药；中成药
摘 要：目的：建立用无毒的乙醇作为反相高效液相色谱流动相溶剂分析中药及中成药有效成分的方法。方法：用乙醇－水系统作反相高效液相色谱流动相测定中药及中成药的主要有效成分, 并与甲醇－水或乙腈－水系统的测定结果进行比较。结果：2种色谱系统均达到基线分离，测得含量基本一致，乙醇系统与甲醇系统或乙腈系统相比，测定相对偏差＜±3％（n = 3）。结论：选择合适的柱温等色谱条件，乙醇可用作反相高效液相色谱流动相分析中药及中成药中有效成分，安全、准确。
甲醇、乙腈为反相高效液相色谱法常用溶剂，均有毒。乙醇与甲醇的理化性质相似却无毒, 但25℃时其粘度是甲醇的2倍［1］, 限制了它在反相高效液相色谱法中的应用。本文以部分常见中药及其成药中有效成分为例，使流动相中乙醇比例在4.75％～66.5％进行研究。结果证明，在一般情况下，适当升高柱温可以用乙醇代替乙腈或甲醇作为反相高效液相色谱流动相溶剂，它在反相色谱中溶剂强度较大，可减少有机溶剂用量，而且乙醇无毒,有利于实验环境的保护。
1 仪器与试药
美国HP1100型高效液相色谱仪，HP1100化学工作站；日本岛津LC－6A液相色谱仪，CR－4A色谱处理机，SPD－6AV紫外检测器。
丹参素对照品（归一化法测定，含量大于98％），上海医科大学提供；射干苷（归一化法测定，含量大于98％），重庆市药检所提供；其余对照品（供含量测定用或归一化法测定含量大于98％）, 中国药品生物制品检定所提供。各种生药市售（ 经本院生药室鉴定，符合中国药典标准）。各种中药
制剂为市售或厂家提供。
乙腈为色谱纯, 其它试剂均为分析纯, 水为超纯水。
2 溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取各种对照品适量，分别用适当的溶剂溶解，制成每1 mL 含黄芩苷0.025 mg、大黄素0.02 mg 、葛根素0.04 mg 、丹参素0.1 mg 、原儿茶醛0.02 mg 、丹参酮ⅡA 0.01 mg、柚皮苷0.06 mg、盐酸小檗碱0.05 mg、盐酸巴马汀0.05 mg、射干苷0.05 mg、蛇床素0.015 mg的溶液作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：采用适当的方法［2～7］分别提取适量生药及制剂，提取液过滤，取续滤液作为供试品溶液。
3 色谱条件
色谱柱：Shimpack CLC－ODS（150 mm ×6 mm, 5 μm），自填国产YWG C18（10 mm ×4.6 mm, 10 μm）作保护柱，除特别指出，流速均为 1 mL.min-1，进样10 μL ，流动相、检测波长、柱温与柱压如下：
3.1 丹参及丹参注射液(华西医科大学制药厂)中丹参素、原儿茶醛 Ⅰ：乙醇－0.2 mol.L-1 醋酸铵(硫酸调pH 2.2)(4.75∶95.25)，280 nm，35 ℃，7.6 MPa；Ⅱ［2］：甲醇－0.2 mol.L-1 醋酸铵(硫酸调pH 2.2)(12 ∶ 88)，280 nm，35 ℃，8.0 MPa；见图1(0.09 AUFS)。
3.2 葛根及松龄血脉康胶囊(成都康弘制药有限公司)中葛根素 Ⅰ： 乙醇－［36%醋酸－水(3 ∶ 72)］(11.4 ∶ 88.6)，247 nm，40 ℃，9.6 MPa；Ⅱ［3］：甲醇－［36%醋酸－水(3∶72)］(25∶75)，247 nm ，35 ℃，11.5 MPa；见图2(0.08 AUFS)。4 结果与讨论
4.1 含量测定的准确性 为考察乙醇用作反相高效液相色谱流动相溶剂测定样品的准确性，本文用甲醇或乙腈作流动相溶剂（文献报道或本实验室未发表的色谱条件）测定同一样品，将乙醇系统测得含量与之比较（均为3次测定平均值），相对偏差均小于3％，见表1。
表1 2种色谱条件测定结果（n = 3）的比较
样品 成分 乙醇系统 甲醇系统 相对偏差
tR/min 含量/% tR/min 含量/% /%
黄芩 黄芩苷 14.1
8.58
13.8
8.70
-1.38
参柴颗粒 黄芩苷 2.11 2.06 2.43
葛根 葛根素 13.7 3.18 12.3 3.23 -1.55
松龄血脉康 葛根素 2.47 2.50 -1.20
大黄 大黄素 11.7 0.14 13.5 0.14 0
异功化瘤颗粒 大黄素 0.011 0.011 0
丹参 丹参素 10.7 0.84 9.9 0.85 -1.18
原儿茶醛 18.5 0.147 17.5 0.147 0
丹参酮ⅡA 11.5 0.184 11.5 0.186 -1.08
丹参片 丹参酮ⅡA 0.0438** 0.0432** 1.39
丹参注射液 原儿茶醛 2.40 2.38 0.84
丹参素 0.227 0.223 1.79
黄连 小檗碱 13.2 6.01 16.0 5.98* 0.50
痛宝胶囊 小檗碱 0.148 0.152* -2.63
射干 射干苷 18.2 0.52 17.4 0.51 1.96
口腔舒 射干苷 1.04 1.02 1.96
蛇床子 蛇床素 9.3 2.24 8.5 2.28 -1.75
洁而阴洗液 蛇床素 0.60 0.60 0
骨碎补 柚皮苷 10.9 1.64 13.2 1.65 -0.61
骨碎补胶囊 柚皮苷 30.91 30.48 1.41
* 为乙腈作流动相溶剂的测定结果
** 单位为每片的毫克数
4.2 柱温及其对色谱柱的影响 本文分析中药及中成药所用乙醇浓度在4.75%～66.5%范围内。由于乙醇粘度高，大多需用较高的柱温：40～60 ℃，以降低获得一定流速所需的柱压。关于柱温对色谱柱寿命的影响，本文未作详细考察, 但同一根色谱柱, 用于较高柱温前用萘测柱效为11 372；于较高柱温连续使用10个月后, 相同的条件测得柱效为9 535（保护柱使用过程中的重新装填, 对色谱总柱效有一定影响）。一般烃类键合相, 只要样品允许, 50～60 ℃是可行的［8］。
4.3 盐酸小檗碱与巴马汀的分离测定 一般文献报道的甲醇－水系统难将2者完全分离, 采用乙腈－水系统离子对色谱法［6］可将2者很好分离，且柱效较高。本文采用乙醇－水系统离子对色谱法，也可将2者完全分离, 但柱效较乙腈－水系统低，且不能将黄连碱与巴马汀很好分离。
4.4 分离度的影响 乙醇与甲醇有相似的选择性，但乙醇分子中多1个－CH2－，使它们仍有差异。比如，在2系统保留时间接近的条件下, 黄芩及制剂中黄芩苷与相邻杂质峰的分离度，乙醇系统明显大于甲醇系统，其机理有待进一步研究。■
参考文献：
［1］达世禄. 色谱学导论. 武昌：武汉大学出版社, 1988.313
［2］李元智，黄英，刘三康等. HPLC测定复方丹参片中原儿茶醛和丹参酮ⅡA.华
西药学杂志，1996，11（4）：213
［3］张志荣，李章万，柯尊洪等. 降压药“松龄血脉康胶囊”的研制. 华西药学杂志，1996，11（2）：65
［4］中国药典.1995.一部:223
［5］郭平，李章万，蒋学华等. HPLC测定12种中药制剂中黄芩甙含量.药物分析杂志，1995，15（5）：13
［6］日本药局方（第十二改正）. 1991. 858
［7］陈发奎. 常用中草药有效成分含量测定. 北京：人民卫生出版社，1997.37
［8］Snyder L R , Kirkland J J 著. 高潮, 陈新民, 高虹译. 现代液相色谱学导论. 第二版. 北京：化学工业出版社, 1988. 269
作者：
付春梅李章万刘三康陈聪 2007-5-18